解迎雙，白興斌，寇宗紅，張 歡，王 波

（1. 蘭州海關(guān)技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730010；2. 白銀市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 蘭州 730999）

0 引言

我國(guó)人口眾多，畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)達(dá)，既是畜產(chǎn)品的消費(fèi)大國(guó)也是畜產(chǎn)品的出口大國(guó)。獸藥在畜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中可謂居功甚偉，增加了養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)各種疾病的抵抗力，減少了養(yǎng)殖動(dòng)物的傷亡，提高了養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。但近年來(lái)，獸藥也暴露出一些違用、濫用的問(wèn)題。甲硝唑是最早在1962 年被發(fā)現(xiàn)的第一代硝基咪唑類藥物，屬人畜共用型藥物，在畜牧產(chǎn)業(yè)中，主要用于治療原蟲(chóng)感染、厭氧菌感染等疾病[1]。恩諾沙星是一種常見(jiàn)的喹諾酮類抗生素，其抗菌活性較強(qiáng)。甲硝唑和恩諾沙星作為硝基咪唑類藥物和喹諾酮類藥物的典型性代表，廣泛應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)中[2-3]。近年來(lái)，由于濫用抗生素類藥物及違法使用的現(xiàn)象，導(dǎo)致含有抗生素殘留的肉類在加工進(jìn)入人體內(nèi)，抗生素類藥物在體中積聚會(huì)引起中毒反應(yīng)、血小板降低、溶血性貧血等各種不良反應(yīng)，嚴(yán)重危害了人類身體健康[4-5]。許多發(fā)達(dá)國(guó)家和組織為了保證動(dòng)物肉類的健康均先后制定頒布了關(guān)于肉類中抗生素的殘留限量的一系列標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)在標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量GB 31650—2019》中，明確了對(duì)豬肉中甲硝唑不得檢出，恩諾沙星可在限量范圍內(nèi)使用，其限量值為100 μg/kg。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于豬肉中甲硝唑和恩諾沙星的檢測(cè)方法，主要包括酶聯(lián)免疫法[6-7]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-9]，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-12]以及液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法[13-16]。其中，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法憑借超快速的掃描，精準(zhǔn)的定量、定性等優(yōu)勢(shì)已成為豬肉中甲硝唑和恩諾沙星的常用檢測(cè)方法。目前，關(guān)于豬肉中甲硝唑和恩諾沙星的檢測(cè)難點(diǎn)主要有：①固相萃取的檢測(cè)步驟較為繁瑣，難以實(shí)現(xiàn)快速高通量的檢測(cè)。②QuEChERS[17]方法未實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、凈化效果差、方法的靈敏度不足。試驗(yàn)建立的Sin-QuEChERS 快速濾技術(shù)結(jié)合超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)豬肉中甲硝唑和恩諾沙星的測(cè)定的方法，Sin-QuEChERS 快速濾技術(shù)，是一種基于QuEChERS 法發(fā)展起來(lái)的一種凈化方法，可用以去除基質(zhì)樣品中的共提取物。該方法凈化材料除采用了QuEChERS 法的常用凈化材料N -丙基乙二胺和十八烷基硅烷鍵合硅膠外，還使用了多壁碳納米管。能夠有效提高填料的凈化速度。與傳統(tǒng)QuEChERS法相比，該方法無(wú)需吸附劑的稱量和提取液的轉(zhuǎn)移，萃取凈化一步完成，大大縮短了凈化時(shí)間，提高了前處理速率和效率。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 設(shè)備設(shè)施

ACQUITY UPLC I-Class 型高效液相色譜儀、Quattro Premier XE 型三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀；BSA822 型電子天平；BCE224i-1CCN 型電子天平；BC-1000 型渦旋振蕩器；3K30 型低溫冷凍高速離心機(jī)；N-EVAP112 型氮吹儀；ZABN2000 型氮?dú)獍l(fā)生器；移液槍。

1.1.2 試劑耗材

甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品（98%）、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品（98%）迪馬科技提供；甲醇為色譜純、乙腈為色譜純、乙酸乙酯為色譜純、正己烷為色譜純、甲酸為色譜純，德國(guó)默克公司提供；無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉，國(guó)藥提供；LM806-FC-724 型Sin-QuEChERS 快速濾過(guò)柱，北京綠綿提供；MCX 固相萃取柱，美國(guó)沃特世公司提供；石墨化碳黑、PSA，美國(guó)安捷倫公司提供；C18色譜柱，美國(guó)安捷倫公司提供；0.22 μm 微孔濾膜，天津艾杰爾公司提供；超純水由實(shí)驗(yàn)室純水儀制備，其他試劑均為分析純。

1.1.3 樣品來(lái)源

豬肉樣品購(gòu)自于大型超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1） 單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。質(zhì)量濃度100 mg/L，分別準(zhǔn)確稱取恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.010 2 g，甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.010 2 g，用甲醇定容至100 mL 容量瓶?jī)?nèi)，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L 的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于-20 ℃冰箱中保存。

（2） 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。質(zhì)量濃度1 000 μg/L，分別移取2 甲硝唑和恩諾沙星單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.00 mL，用甲醇定容至100 mL 容量瓶中，配置成質(zhì)量濃度為1 000 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

（3） 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。質(zhì)量濃度100 μg/L，分別移取甲硝唑和恩諾沙星的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.00 mL，用甲醇定容至100 mL 容量瓶中，配置成質(zhì)量濃度為100 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取粉碎后的豬肉樣品5.00 g（精確至±0.01 g）于50 mL 離心管中，加入5 mL 后水渦旋3 min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%乙酸的乙腈溶液（體積比）10 mL，渦旋3 min，于常溫超聲15 min。加入6 g無(wú)水硫酸鎂（預(yù)先烘干），1.5 g 氯化鈉（預(yù)先烘干）后立刻劇烈渦旋3 min，并以轉(zhuǎn)速13 000 r/min 離心5 min。取上清液置于帶有刻度的15 mL 離心管中，于45 ℃氮?dú)獯抵? mL，將濃縮液加載至LM806-FC-724 型Sin-QuEChERS 快速濾過(guò)凈化柱內(nèi)，在該柱下方，連接1 個(gè)0.22 μm 的有機(jī)相濾膜。下壓柱塞桿，使?jié)饪s液通過(guò)快速過(guò)濾柱和有機(jī)相濾膜后，收集于一進(jìn)樣小瓶?jī)?nèi)，供UPLC-MS/MS 測(cè)定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

ZORBAXEclipsePlus C18色譜柱（100 mm，2.1 mm，1.8 μm）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積2 μL；流量0.3 mL/min；流動(dòng)相A 為1%甲酸溶液，B 為乙腈。

梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

ESI 離子源；毛細(xì)管電壓4 000 V；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流量10 L/min；霧化器壓力14 kPa；正離子源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM） 模式。

質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

通過(guò)對(duì)質(zhì)量濃度為10 μg/L 的甲硝唑和恩諾沙星的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，對(duì)儀器工作條件進(jìn)行優(yōu)化。選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM） 模式，采用1 個(gè)母離子和與之相對(duì)應(yīng)的2 個(gè)子離子組成的離子對(duì)的方式，對(duì)恩諾沙星和甲硝唑進(jìn)行了二次定性，增加了定性的準(zhǔn)確性。以10 μg/L 單標(biāo)準(zhǔn)溶液分別重復(fù)進(jìn)樣12次，按照國(guó)際對(duì)離子豐度比最大偏差允許值的范圍要求，計(jì)算甲硝唑和恩諾沙星的2 個(gè)定性離子之間的豐度比平均值作為該化合物的抗干擾指標(biāo)。結(jié)果表明，甲硝唑和恩諾沙星的離子豐度比均在要求范圍內(nèi)。

甲硝唑和恩諾沙星總離子色譜圖見(jiàn)圖1，甲硝唑10 μg/L 與恩諾沙星10 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（MRM）見(jiàn)圖2。

圖1 甲硝唑和恩諾沙星總離子色譜圖

圖2 甲硝唑10 μg/L 與恩諾沙星10 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（MRM）

2.2 提取溶劑的選擇

分別以1%乙酸乙腈（體積比）、乙腈溶液、乙酸乙酯溶液作為提取溶劑提取樣品中的甲硝唑和恩諾沙星。試驗(yàn)結(jié)果表明，乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)，對(duì)樣品中的脂肪和蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)有較大的溶解度，在后續(xù)的濃縮試驗(yàn)過(guò)程中易產(chǎn)生油狀物，凈化過(guò)程中易造成快速濾過(guò)柱的堵塞且上機(jī)檢測(cè)過(guò)程中有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。乙腈作為提取溶劑，在提取過(guò)程中對(duì)蛋白有較好的沉淀作用，可以部分去除肉類樣品中的蛋白質(zhì)，降低了基質(zhì)對(duì)恩諾沙星和甲硝唑的吸附并提高其回收率[18-20]，但采用乙腈作為提取溶劑時(shí)，甲硝唑的回收率較低為60%~80%。使用含1%乙酸的乙腈溶液為提取劑時(shí)，甲硝唑的回收率明顯提高，回收率可達(dá)96%以上。因此，選擇含1%乙酸的乙腈溶液作為豬肉中甲硝唑和恩諾殺星的提取溶劑。

2.3 凈化條件的選擇

分別選擇MCX 固相萃取柱、QuEChERS、Sin-QuEChERS 快速濾技術(shù)對(duì)其進(jìn)行凈化處理。通過(guò)回收率、操作步驟的難易程度、試劑消耗量、操作速度等4 個(gè)因素對(duì)凈化方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

凈化條件比對(duì)表見(jiàn)表3。

表3 凈化條件比對(duì)表

由表3 可知，3 種凈化方法的回收率均能達(dá)到方法學(xué)考查的要求，但是Sin-QuEChERS 快速濾技術(shù)操作步驟簡(jiǎn)便、試劑消耗量小更適合于本實(shí)驗(yàn)的要求。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制） 逐級(jí)稀釋，配制恩諾沙星和甲硝唑的質(zhì)量濃度分別為0.50，1.00，10.00，100.00，200.00，500.00 μg/L 6個(gè)梯度濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。將該標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度系列按照1.4 中的儀器條件進(jìn)行測(cè)定，以甲硝唑和恩諾沙星的質(zhì)量濃度作為曲線的橫坐標(biāo)，以篩選出的甲硝唑和恩諾沙星的定量離子的峰面積作為曲線的縱坐標(biāo)，分別繪制恩諾沙星和甲硝唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制1 000 μg/L）稀釋至0.50，1.50，5.0 μg/L 質(zhì)量濃度后依次添加至豬肉樣品中，按照1.3-1.4 的試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)后，以3 倍信噪比（3 S/N） 計(jì)算檢出限。

線性參數(shù)和檢出限見(jiàn)表4。

表4 線性參數(shù)和檢出限

由表4 可知，甲硝唑和恩諾沙星的線性范圍較寬，檢出限滿足測(cè)定要求。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密度用以表示測(cè)定方法的再現(xiàn)性，以保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確[21-23]。按照1.3-1.4 的試驗(yàn)方法對(duì)同一樣品進(jìn)行測(cè)定（n=7）。

精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=7） 見(jiàn)表5。

表5 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=7）

由表5 可知，甲硝唑和恩諾沙星測(cè)定值的RSD為3.1%~3.6%，說(shuō)明該方法在對(duì)甲硝唑和恩諾沙星進(jìn)行檢測(cè)時(shí)的精密度較好，符合方法學(xué)要求。

2.6 回收試驗(yàn)

按照（1.3-1.4） 試驗(yàn)方法對(duì)空白豬肉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)的質(zhì)量濃度為2.00，6.00，20.0 μg/L，每個(gè)濃度值平均測(cè)定6 次，以6 次平均值計(jì)算回收率。

回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 回收試驗(yàn)結(jié)果

由表6 可知，甲硝唑和恩諾沙星的回收率為96.0%~107%，可滿足該方法對(duì)豬肉中甲硝唑和恩諾沙星的檢測(cè)要求。

2.7 實(shí)際樣品分析

對(duì)蘭州市的8 家大型超市中所售的豬肉樣品采用試驗(yàn)優(yōu)選的方法，分別抽取20 批次進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，甲硝唑和恩諾沙星化合物均未檢出。

3 結(jié)論

針對(duì)豬肉樣品基質(zhì)復(fù)雜的特點(diǎn)，采用1%乙酸乙腈直接提取，經(jīng)快速濾過(guò)柱凈化，結(jié)合UPLCMS/MS，建立了豬肉中甲硝唑和恩諾沙星的快速定性定量分析的方法，并運(yùn)用所建立的方法檢測(cè)20 批次豬肉樣品。與傳統(tǒng)的樣品預(yù)處理方法相比較，該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速高效、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，為日常大量茶葉樣品中獸藥殘留的快速篩查提供了一條新的途徑。