田露琴，戴怡鳳,2*，徐浩，邱樹毅

1(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025) 2(北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心(北京工商大學(xué))，北京，100048)

飲料酒種類繁多、風(fēng)格各異，具有良好的風(fēng)味和口感，適量地飲用飲料酒對人體健康具有一定的益處[1]。飲料酒的風(fēng)味組成逐漸受到關(guān)注，其中手性物質(zhì)的研究已成為熱點，徐浩等[2]總結(jié)了飲料酒中已報道的手性風(fēng)味物質(zhì)，包括酯類11種、醇類5種、酸類7種、醛酮類4種、硫醇類2種、萜烯類12種。

手性分子在化學(xué)和生物學(xué)中普遍存在，手性化合物的測定在醫(yī)藥、生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)藥和食品等領(lǐng)域都是非常重要的課題。如在香料和葡萄酒領(lǐng)域，手性化合物不同構(gòu)型在體系中的分布情況可能會影響體系的風(fēng)味[3-5]。手性對映體的研究可以用于質(zhì)量控制，檢測樣品是否摻假，確定產(chǎn)品基質(zhì)的地理來源等[6]。如LANGEN等[7]對不同產(chǎn)地的葡萄酒中α-紫羅蘭酮的2種構(gòu)型進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-紫羅蘭酮的R-構(gòu)型占有很大的優(yōu)勢，超過99%，此結(jié)論可用作葡萄酒中潛在的摻假標(biāo)記。1,2-丙二醇在工業(yè)上通常以外消旋的形式存在，其對映體的比例可以作為區(qū)分白酒香氣風(fēng)格的潛在標(biāo)志，可能是鑒別白酒品質(zhì)和香氣風(fēng)格的一種新途徑[8]。有研究表明，對映體可以以不同的方式與受體、轉(zhuǎn)運系統(tǒng)或酶相互作用，從而產(chǎn)生不同的味道、香氣或不同的生物活性等[9]。如葡萄酒中(S)-(-)-α-松油醇有針葉樹香氣，(R)-(+)-α-松油醇有花香，類似丁香花的氣味;(R)-(+)-檸檬烯，具有令人愉快的、新鮮的柑橘香氣，而(S)-(-)-檸檬烯具有微弱的薄荷和松油味[10-12]。氨基酸對人體來說是一類重要的化合物,對于含有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的食品添加劑，只允許使用L-氨基酸，這是它們的天然構(gòu)型。它們相關(guān)的D-構(gòu)型可能具有不同的生物學(xué)或生理學(xué)特性，并且可能無法有效代謝。因此，食品中存在的D-氨基酸可能會導(dǎo)致營養(yǎng)不良和不安全的產(chǎn)品[13]。

飲料酒中大部分手性風(fēng)味物質(zhì)含量都較低，將其高效地提取出來在整個分析過程中極為重要，關(guān)系到工作效率及分析結(jié)果的可靠性。本文總結(jié)了飲料酒手性風(fēng)味物質(zhì)提取方法以及分析方法，為以后飲料酒中手性風(fēng)味物質(zhì)的研究提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 飲料酒手性風(fēng)味物質(zhì)提取方法

研究飲料酒中的手性風(fēng)味物質(zhì)，首先要對其進行富集。飲料酒中手性風(fēng)味物質(zhì)的萃取技術(shù)主要有液-液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)、頂空-固相微萃取(headspace solid phase microextraction, HS-SPME)、溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)技術(shù)(solvent-assisted flavor evaporation, SAFE)以及直接進樣(direct injection, DI)等。表1總結(jié)了常見手性風(fēng)味物質(zhì)提取方法以及飲料酒中適用范圍。

表1 常見手性風(fēng)味物質(zhì)提取方法及適用范圍Table 1 Extraction methods and application scope of common chiral flavor substances

1.1 液液萃取

液液萃取技術(shù)是一種利用有機化合物在2種互不相溶或微溶的溶劑中溶解度或分配比不同而進行分離的一種方法，它具有回收率較好，萃取效率高，操作簡單等優(yōu)點，是飲料酒前處理方式中常用的一種[14]。LYTRA等[15]通過LLE和GC-MS分析了87種不同年份和來源的商業(yè)葡萄酒中3-羥基丁酸乙酯對映體。PONS等[22]通過LLE處理樣品后進行GC-MS 分析，成功定量了3-羥基-4,5-二甲基-2(5H)-呋喃酮及其前體2-酮丁酸。

1.2 固相微萃取

固相微萃取技術(shù)是利用聚合物膜包裹熔融硅纖維來收集樣品中的揮發(fā)性組分，現(xiàn)在已經(jīng)有極性、非極性以及混合型的纖維涂層，SPME可分為2種，一種是頂空固相微萃取，一種是浸入式固相微萃取[44-45]。固相微萃取有快速、易于使用和無溶劑等優(yōu)點，但樣品的萃取依賴萃取頭的性質(zhì)。SONG等[38]利用HS-SPME結(jié)合二維氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(two dimensional gas chromatography-mass spectrometry，MDGC-MS)對白葡萄酒中手性單萜進行定量分析，結(jié)果顯示在分析的葡萄酒中檢測到的每種手性化合物都有顯著差異。表2總結(jié)了固相微萃取不同萃取頭類型以及適用范圍等。

1.3 其他方法

DI操作簡單快速，但是無法檢測出飲料酒中含量較低的化合物[47]，XU等[8]通過DI成功從醬香型、濃香型、清香型3種不同香型白酒中提取出了1,2-丙二醇對映體。SAFE利用超低溫的冷阱與真空泵相連接，溶劑萃取物在低溫和高壓的條件下被分離，MATHEIS等[26]對發(fā)酵食品進行SAFE處理后，成功對樣品中L-異亮氨酸通過Ehrlich途徑降解得到的代謝物進行定量以及測定了2-甲基丁醛、2-甲基-1-丁醇對映體比例。

表2 不同萃取頭及其應(yīng)用[14, 46]Table 2 Different extraction heads and their applications

2 手性物質(zhì)分析方法

手性化合物具有相似的理化性質(zhì)，這類化合物不能利用常規(guī)介質(zhì)分離，只有引入手性環(huán)境，才能分離此類化合物。手性分離有2種方式，一種是手性異構(gòu)體與手性選擇劑形成穩(wěn)定的非手性異構(gòu)體，通過常規(guī)固定相分離；另一種是基于手性異構(gòu)體與手性選擇劑形成不穩(wěn)定的手性異構(gòu)體進行分離[48]。手性選擇劑作為手性柱的一個重要部分，它可以粘接在毛細(xì)管柱內(nèi)壁的固定相上，形成手性固定相。手性固定相的種類很多，選擇手性固定相的類型時，要了解對映異構(gòu)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)[49]。

目前已有幾種分析方法用于飲料酒中手性風(fēng)味物質(zhì)的檢測，包括手性氣相色譜(gas chromatography，GC)[13-14]、HPLC[50]、超臨界流體色譜(supercritical fluid chromatography，SFC)[51-53]、毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)[54]和毛細(xì)管電色譜(capillary electrochromatography, CEC)[55-56]等。選擇不同的分離方法時，應(yīng)考慮手性異構(gòu)體的理化性質(zhì)，LC、HPLC、CE和SFC適用于分析熱不穩(wěn)定性對映異構(gòu)體，GC適用于分析揮發(fā)性對映異構(gòu)體，SFC基于高于其臨界點溫度和壓力下用作流動相的溶劑使用，可以采用高流速并實現(xiàn)快速傳質(zhì)，從而實現(xiàn)快速高效的分離，CE和CEC是小型化技術(shù)，由于它們的微流體性質(zhì)和較低的樣品容量，主要用于分析[57]。飲料酒中手性風(fēng)味物質(zhì)的研究大多采用手性氣相色譜法和液相色譜法。

手性固定相是手性風(fēng)味物質(zhì)檢測最重要的一部分，選擇合適的手性色譜柱對目標(biāo)手性化合物的拆分至關(guān)重要。然而，找到合適的手性固定相仍然是一個試錯過程，目前已報道了一系列的環(huán)糊精、衍生多糖、糖肽類抗生素手性固定相用于氣相色譜和液相色譜等。有關(guān)手性固定相種類及其相關(guān)應(yīng)用如表3所示。表4概括了文獻(xiàn)中飲料酒中手性風(fēng)味化合物常用的分析色譜柱，包括色譜柱型號、固定相、適用的手性風(fēng)味化合物。

表3 不同手性固定相及其應(yīng)用Table 3 Different chiral stationary phases and their applications

表4 飲料酒中手性風(fēng)味物質(zhì)分析常用色譜柱Table 4 Common chromatographic columns for analysis of chiral flavor substances in alcoholic beverages

在分析樣品時，應(yīng)充分考慮到不同的手性化合物具有不同的性質(zhì)，從而選擇合適的手性柱。環(huán)糊精類手性固定相是商業(yè)化最廣泛的一類固定相，適用于多種手性化合物的分離，其中，CHIRALDEX G-TA(γ-環(huán)糊精)對短鏈有機酸表現(xiàn)出良好的分離效果，CYCLOSIL-B能分離開1,2-丙二醇、2-丁醇以及2,3-丁二醇等醇類手性物質(zhì)，MEGA DEX DAC-Beta和MEGA-DEX DMT-Beta上粘接的β-環(huán)糊精對內(nèi)酯類手性物質(zhì)具有很好的分離能力，Rt?-β DEX系列(sm、sa、se)的手性柱更適用于芳樟醇、松油醇、檸檬烯、香茅醇等萜烯類手性化合物的分離。

2.1 手性氣相色譜

氣相色譜是一種新型的分離、分析技術(shù)，通常情況下，所需進樣量較少，因此在眾多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。GC-MS、MDGC-MS等都已成為風(fēng)味分析領(lǐng)域的重要技術(shù)手段。氣相色譜通常與檢測器相結(jié)合，包括氫火焰離子檢測器(flame ionization detector， FID), 火焰光度檢測器(flame photometric detector， FPD)等[62]。本文綜述的手性風(fēng)味化合物在氣相色譜分析中較多選擇的是FID和質(zhì)譜。

2.1.1 氣相色譜技術(shù)

氣相色譜技術(shù)出現(xiàn)于20世紀(jì)50年代，ASTRID等[63]利用手性GC-FID分離了葡萄酒中乳酸乙酯對映體。余書奇等[27]建立了手性GC-FID分離輻照酒中(2S, 3S)-(+)-丁二醇、(2R, 3R)-(-)-丁二醇以及meso-(R,S)-丁二醇的分離方法，為鑒別白酒是否經(jīng)過輻照提供了依據(jù)。

2.1.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)出現(xiàn)于20世紀(jì)60年代，氣相色譜與質(zhì)譜通過接口連接，樣品經(jīng)色譜柱被分離成單一組分后進入質(zhì)譜進行檢測，由于分離能力較好、靈敏度較高，非常適用于揮發(fā)性手性風(fēng)味成分的分析[64]。手性GC-MS通過手性固定相(通常為改性環(huán)糊精)與對映體強弱不一的相互作用來實現(xiàn)對映體分離的[65]。王明等[4]運用固相支撐-液液萃取(solid-supported liquid-liquid extraction， SLE)方法和GC-MS對醬香型、濃香型和清香型白酒中D-乳酸乙酯、L-乳酸乙酯和(S)-2,3丁二醇、(R)-2,3丁二醇、meso-2,3-丁二醇進行了定性與定量分析。LYTRA等[15]利用GC-MS技術(shù)實現(xiàn)了葡萄酒中3-羥基丁酸乙酯的手性分離，同時還指出3-羥基丁酸乙酯在葡萄酒中具有特征的對映體分布，而隨著葡萄酒陳釀過程的增加，其對映體的分布也會發(fā)生變化。乙酸2-甲基丁酯廣泛存在于各種飲料和水果中，其S-構(gòu)型帶有黑莓和香蕉的香氣，乙酸2-甲基丁酯常出現(xiàn)在乙烯產(chǎn)生的前幾周。因此，根據(jù)其濃度可以預(yù)測收獲期，有報道利用手性GC-MS技術(shù)成功分離定量了78種紅葡萄酒和28種白葡萄酒中乙酸2-甲基丁酯對映體[19]。STEINHAUS等[39]采用SIDA結(jié)合手性GC-MS對5種不同類型啤酒中2種芳樟醇對映體進行定量分析，結(jié)果顯示，2種芳樟醇的R/S比值存在顯著差異。

2.1.3 二維氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

飲料酒風(fēng)味物質(zhì)種類繁多，難以實現(xiàn)滿意的分離，通常需要大幅提高常規(guī)使用的一維色譜技術(shù)的分辨率，因此，MDGC-MS逐漸成為熱門技術(shù)，通過第一根非手性柱對樣品進行預(yù)分離。

ZHANG等[66]利用HS-SPME-MDGC-MS在用香菇發(fā)酵的飲料中觀察到高達(dá)35%的(R)-2-甲基丁酸甲酯(M2MB)。PONS等[31]選擇手性MDGC-MS技術(shù)研究了不同年份葡萄酒中的香氣化合物，并在葡萄酒中發(fā)現(xiàn)了萜烯類化合物薄荷酮。LANGEN等[25]利用手性MDGC-MS技術(shù)實現(xiàn)了1,2-丙二醇的對映體分離，研究了1,2-丙二醇在各種葡萄酒中的天然濃度和對映體分布，在所研究的葡萄酒中，1,2-丙二醇的R-構(gòu)型占優(yōu)勢。SONG等[38]利用HS-SPME-MDGC-MS建立了一種有效的白葡萄酒中手性單萜的定量方法，結(jié)果顯示在分析的葡萄酒中檢測到的每種手性化合物都有顯著差異，該方法能夠?qū)⒉煌瑢τ丑w的質(zhì)量濃度量化到1 ng/L。為了對“貴腐”葡萄和葡萄酒中的主要手性揮發(fā)有機物進行定量分析，MACHYKOV等[11]將葡萄酒和葡萄汁通過SPME處理后，一維GC為DB-FFAP色譜柱，二維GC選用涂抹了二甲基聚硅氧烷環(huán)糊精的CHIRASIL-DEX色譜柱或者涂抹了6-叔丁基二甲基硅基-2,3-二-O-甲基-β-環(huán)糊精的MEGA-DEX DMT-Beta色譜柱，在未感染的葡萄中檢測到近100個揮發(fā)性有機化合物，而它們的數(shù)量與葡萄品種有著巨大的關(guān)系。

GC、GC-MS和MDGC-MS都各有優(yōu)勢和不足，GC在對組分直接進行分析時，必須用已知物純樣品與相應(yīng)的色譜峰進行對比。GC-MS在風(fēng)味分析檢測領(lǐng)域一直以來都炙手可熱，但隨著科技的發(fā)展，對分析的要求越來越高，GC-MS由于其峰容量較小、分析時間長等缺點，對手性分析的研究有一定的限制，但是，由于其經(jīng)濟性和可操作性，該技術(shù)仍然起著重要的作用。MDGC-MS靈敏度高，分析獲得的風(fēng)味物質(zhì)較GC-MS更多、更精確，然而只能對被預(yù)分離后的一小部分物質(zhì)進行再次分離，且也有可能出現(xiàn)峰重疊的現(xiàn)象，若要實現(xiàn)對多種手性化合物的分析，需要進行多次中心切割，操作較為繁瑣。因此，在實際的樣品分析中，應(yīng)根據(jù)分析的目標(biāo)和要求選擇適合的分析方法。

2.2 手性液相色譜

混合物中各個組分的性質(zhì)不同，對液相色譜中兩相的親和力也有所差異，液相色譜正是根據(jù)這種差異將混合物中各組分進行分離。手性液相色譜法常用來分析手性風(fēng)味化合物。常用技術(shù)有：HPLC、UPLC、LC-MS/MS等。手性HPLC大多使用多糖類手性固定相對手性立體異構(gòu)體進行拆分[67]。

2.2.1 HPLC及UPLC

HPLC法是手性拆分中使用最為普遍的方法，主要包括3種方法：手性衍生化試劑法、手性流動相添加劑法和手性固定相法[68]。LASEKAN等[24]利用手性HPLC帶UV檢測器對3種不同棕櫚酒中的3種關(guān)鍵揮發(fā)物的對映體進行了鑒別，選用CHIRALPAK AS-H色譜柱成功分離了芳樟醇的消旋體。另外，STAMATOPOULOS等[21]利用上述同型號的色譜柱成功分離了2-壬烯-4-內(nèi)酯。UPLC分離化合物的原理與HPLC基本相同，但其效率更高，能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測[69]。江鋒等[40]利用超高效液相色譜儀帶二極管陣列檢測器和手性分離柱(Chirex 3126 (D)-penicillami(4.6 mm ×250 mm, 5 μm))對20種市售的不同香型白酒中D-乳酸、L-乳酸成功進行了分離測定。

2.2.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)在分離對映體方面占有一席之地，是一種結(jié)合了液相與質(zhì)譜的分析方法，液相色譜法用于分離組分的混合物；通過質(zhì)譜法，我們可以根據(jù)其分子質(zhì)量確定具有較高特異性和靈敏度的單個組分的結(jié)構(gòu)[70]。近年來，該技術(shù)在臨床醫(yī)藥和食品工業(yè)領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注，NAKANO等[71]曾報道了一種使用LC-MS/MS進行手性氨基酸對映體分離的高靈敏度分析方法，無需任何衍生過程。該方法可同時分析18種D-氨基酸，靈敏度高，重現(xiàn)性好。CHEN等[29]利用 LC-MS/MS法分析了葡萄酒中的3-硫基-1-己醇、3-硫基-1-己酸乙酯對映體。

UV檢測器是目前HPLC應(yīng)用最廣泛的檢測器，其檢測要求被檢測樣品組分具有紫外吸收，通常選擇在被分析物有最大吸收的波長處進行檢測，但是這會導(dǎo)致樣品中其他組分在該通道下的吸收變?nèi)跎踔翢o紫外吸收。因此，單通道紫外檢測器不適用于多種手性化合物的檢測。二極管陣列檢測器是一種新型的光吸收檢測器，它能形成多通道并行工作，可得任意波長的色譜圖。但相對來說，專門的紫外檢測器靈敏度能高一些。

2.3 其他方法

手性化合物其他的分析方法主要有超臨界流體色譜、毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管電色譜。SFC是以超臨界流體為流動相的一種色譜方法，具有氣相和液相所沒有的優(yōu)點，并能分離氣相色譜和液相色譜不能解決的一些對象，發(fā)展十分迅速。CE是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術(shù)；CEC以內(nèi)含色譜固定相的毛細(xì)管為分離柱，兼具毛細(xì)管電泳以及高效液相色譜的雙重分離機理，既可分離帶電物質(zhì)也可分離中性物質(zhì)。KODAMA等[41]利用CE法測定日本18個不同品牌的清酒釀造過程中的D-乳酸、L-乳酸的含量，D-乳酸(140～274 mg/L)含量大于L-乳酸(61～461 mg/L)。MIAO等[72]建立了一種新型的手性毛細(xì)管電泳方法對6種氨基酸對映體進行了分離，并測定了黃酒中D-谷氨酸和D-天冬氨酸，在確定了電解質(zhì)的pH、硼酸濃度、D-果糖和異丙醇的加入以及新的二元手性選擇器對電泳圖的影響后，該方法成功應(yīng)用于7份黃酒樣品中D/L-谷氨酸和D/L-天冬氨酸的濃度分析。

3 總結(jié)

飲料酒中不同手性風(fēng)味化合物的分布、含量對飲料酒的品質(zhì)、風(fēng)格等具有一定的影響，經(jīng)過不斷的研究與創(chuàng)新，飲料酒中手性風(fēng)味物質(zhì)的提取和分離方法也得到了革新。本文總結(jié)了飲料酒手性風(fēng)味物質(zhì)提取、分離及檢測方法，旨在為以后飲料酒中手性風(fēng)味物質(zhì)的研究提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。

對飲料酒中手性風(fēng)味物質(zhì)的提取方法主要有液液萃取、固相微萃取、超臨界流體萃取等，樣品的前處理方法對后續(xù)分離檢測十分重要，應(yīng)根據(jù)樣品的種類，選擇不同的提取方法。分析手性風(fēng)味物質(zhì)最常用的技術(shù)有手性氣相色譜法和手性液相色譜法，不同的固定相對異構(gòu)體的分離效果不一樣，固定相的選擇對高效分離異構(gòu)體具有重要意義，手性氣相色譜法多使用環(huán)糊精類手性固定相對目標(biāo)化合物進行拆分，而手性HPLC大多使用多糖類手性固定相對手性立體異構(gòu)體進行分離。目前，某些含量較低的化合物提取起來較困難，過程中造成的誤差也較大，對于立體異構(gòu)體的檢測技術(shù)還不夠成熟，沒有一種技術(shù)能夠完全分離出所有的手性物質(zhì)。因此，在未來的研究中，應(yīng)對上述問題進行更加深入的探索與研究。