宋欠紅 樊 睿 李 易 李戈媛 葉 勇 趙 淳

(云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管病科，云南 昆明 650021)

動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病的重要病理變化之一，可隨著年齡增長(zhǎng)而加重[1]。動(dòng)脈粥樣硬化是多種因素引起的慢性、彌漫性、漸進(jìn)性炎癥病變，是血管壁對(duì)多種損傷的異常反應(yīng)，具有變性、增殖的典型炎癥特點(diǎn)[2-3]。芪蛭通脈顆粒是我們根據(jù)益氣活血通絡(luò)法結(jié)合云南民族醫(yī)藥創(chuàng)制的治療冠心病的經(jīng)驗(yàn)方，前期研究表明芪蛭通脈顆粒對(duì)冠心病胸悶、胸痛、氣短及血脂異常均有很好療效[4-5]。為進(jìn)一步研究芪蛭通脈顆粒治療冠心病的作用機(jī)制，本研究通過(guò)觀察芪蛭通脈顆粒對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化大鼠冠狀動(dòng)脈組織Toll樣受體4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)蛋白表達(dá)及血清白細(xì)胞介素6(IL-6)、IL-8、IL-10水平的影響[6-8]，探討芪蛭通脈顆粒治療冠心病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量240～280 g，自由飲水進(jìn)食，飼養(yǎng)溫度(20±2)℃，濕度25%～60%，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滇)2018-0003，大鼠合格證號(hào)：430067000011726。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 芪蛭通脈顆粒(藥物組成：炙黃芪20 g,水蛭粉3 g,紅曲6 g，燈盞細(xì)辛15 g，三七6 g，均采用中藥顆粒劑，四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司提供)；阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20051408)；垂體后葉素注射液(上海禾豐制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31022751)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 IL-6、IL-8及IL-10酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)定試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)；TLR4及NF-κB蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；兔源TLR4/NF-κB抗體(美國(guó)Cell signaling technology公司)；電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；凝膠成像設(shè)備(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模與分組 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、阿托伐他汀鈣組及芪蛭通脈低、中、高劑量組，每組10只。參照相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]制作大鼠冠狀動(dòng)脈粥樣硬化模型。除空白對(duì)照組外，其余各組均給予高脂飼料(87.3%基礎(chǔ)飼料，2%膽固醇，10%豬油，0.5%膽酸鈉，0.2%丙基硫氧嘧啶)喂養(yǎng)8周(56 d)，按5 g/kg灌胃，每日1次，空白對(duì)照組給予5 mL/kg蒸餾水灌胃。其中從第53 d開(kāi)始，模型組、阿托伐他汀鈣組及芪蛭通脈低、中、高劑量組給予垂體后葉素注射液3 U/(kg·d)腹腔注射，連續(xù)給藥3 d。第3次注射完畢后30 min內(nèi)進(jìn)行心電圖檢測(cè)，若肢體導(dǎo)聯(lián)ST段抬高超過(guò)0.1 mV，或有T波高聳，則視為造模成功[11]。

1.4.2 給藥方法 于第9周開(kāi)始藥物干預(yù)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與成人用藥量的換算方法：人用量×0.0026×50=大鼠用量/kg體質(zhì)量[12]。芪蛭通脈低、中、高劑量組分別按6.5、13、26 g/(kg·d)給予芪蛭通脈水溶液灌胃，阿托伐他汀鈣組按13 mg/(kg·d)給予阿托伐他汀鈣水溶液灌胃，空白對(duì)照組按5 mL/kg給予蒸餾水灌胃。各組均連續(xù)灌胃4周。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 血液指標(biāo) 各組均連續(xù)灌胃4周后，予以腹腔內(nèi)注入10%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉，然后將大鼠四肢、頭部固定，仰臥位，0.22%碘伏消毒皮膚，切開(kāi)腹壁組織，暴露腹主動(dòng)脈，在腹主動(dòng)脈處采動(dòng)脈血5 mL，1 500 r/min離心15 min后，取上清液置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用ELISA法檢測(cè)血清IL-6、IL-8及IL-10水平，嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5.2 心肌組織指標(biāo) 各組大鼠抽血完畢后，打開(kāi)胸腔，充分暴露并取下心臟，采用Western blot法檢測(cè)心肌組織TLR4及NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)情況[13-14]。摘取前降支、回旋支、右冠狀動(dòng)脈等冠狀動(dòng)脈組織，每只大鼠取3 mm×3 mm，用眼科剪剪碎，放置于10 mL離心管中，加入裂解液，勻漿器充分勻漿，使其充分裂解，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，4 ℃，1200 r/min離心15 min，取上清液，保存于-80 ℃環(huán)境中。然后按照Western blot法操作說(shuō)明書進(jìn)行，以GAPDH內(nèi)參，得出待測(cè)蛋白的條帶后，用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描蛋白條帶后進(jìn)行光密度分析，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 造模情況 造模后，各組大鼠活動(dòng)減少，飲水減少，毛色光澤度下降，其中模型組大鼠死亡2例，芪蛭通脈中劑量組大鼠死亡1例，其余大鼠均造模成功。

2.2 各組大鼠灌胃后血清IL-6、IL-8、IL-10水平比較 與空白對(duì)照組比較，模型組血清IL-6、IL-8水平均升高(P<0.05)，IL-10水平降低(P<0.05)。與模型組比較，芪蛭通脈中、高劑量組血清IL-6、IL-8水平均降低(P<0.05)，芪蛭通脈高劑量組IL-10水平升高(P<0.05)，阿托伐他汀鈣組、芪蛭通脈低劑量組IL-6、IL-8、IL-10水平及芪蛭通脈中劑量組IL-10水平與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。芪蛭通脈3個(gè)劑量組組間比較，芪蛭通脈高劑量組血清IL-6、IL-8水平均低于芪蛭通脈低劑量組(P<0.05)、IL-10水平高于芪蛭通脈低劑量組(P<0.05)，IL-8水平低于芪蛭通脈中劑量組(P<0.05)，芪蛭通脈中劑量組IL-6、IL-8水平均低于芪蛭通脈低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠灌胃后血清IL-6、IL-8、IL-10水平比較

2.3 各組大鼠冠狀動(dòng)脈組織TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較，模型組冠狀動(dòng)脈組織TLR4、NF-κB相對(duì)表達(dá)升高(P<0.05)。與模型組比較，芪蛭通脈低、中、高劑量組冠狀動(dòng)脈組織TLR4、NF-κB相對(duì)表達(dá)均降低(P<0.05)，阿托伐他汀鈣組僅NF-κB相對(duì)表達(dá)降低(P<0.05)，阿托伐他汀鈣組TLR4相對(duì)表達(dá)與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。芪蛭通脈3個(gè)劑量組組間比較，芪蛭通脈低、中、高劑量組冠狀動(dòng)脈組織TLR4、NF-κB相對(duì)表達(dá)組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組大鼠冠狀動(dòng)脈組織TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)比較

注：A空白對(duì)照組；B模型組；C阿托伐他汀鈣組；D芪蛭通脈低劑量組；E芪蛭通脈中劑量組；F芪蛭通脈高劑量組圖1 各組大鼠冠狀動(dòng)脈組織TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)情況

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其特點(diǎn)是動(dòng)脈管壁增厚、變硬，失去彈性和管腔縮小，由于在動(dòng)脈內(nèi)膜上積聚的脂質(zhì)外觀呈黃色粥樣，因此稱為動(dòng)脈粥樣硬化。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平的發(fā)展，人們飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，高油、高鹽、高糖飲食，運(yùn)動(dòng)量不足，工作壓力大，使動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病率逐年增加。TLR4/NF-κB是人和大鼠動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中重要的信號(hào)通路。NF-κB是TLR下游的重要因子，參與動(dòng)脈粥樣硬化的各個(gè)階段，能夠反映動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，在其形成過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[15]。研究表明，斑塊不穩(wěn)定和斑塊破裂可使TLR4/NF-κB信號(hào)通路高表達(dá)[16]。IL-6是人體重要的促炎因子，主要由單核-巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等合成分泌，在血液中廣泛存在，IL-6與受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞分化、成熟和凋亡，是動(dòng)脈粥樣硬化及血管炎性反應(yīng)過(guò)程中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[17]。IL-8作為典型的炎癥趨化因子，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，其可能作用機(jī)制包括:①促進(jìn)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，參與早期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成；②誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞到達(dá)已受損的血管內(nèi)皮，啟動(dòng)凝血系統(tǒng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使斑塊破裂出血[18-19]。IL-10是重要的抗炎因子，可以減少細(xì)胞凋亡，抑制巨噬細(xì)胞活化，也抑制活化基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPS)和炎癥因子生成，在抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的同時(shí)增加自身表達(dá)，下調(diào)黏附分子表達(dá)，減少脂質(zhì)堆積[20]。

冠心病屬中醫(yī)學(xué)胸痹、胸痛等范疇，瘀血阻絡(luò)是其發(fā)生的主要病因病機(jī)。平素嗜食膏粱厚味，損傷脾胃，助濕生熱，熱耗津液，導(dǎo)致心脾氣虛，運(yùn)化失常，轉(zhuǎn)化為痰濁脂液，導(dǎo)致氣血受阻，氣機(jī)運(yùn)行不暢，氣結(jié)血凝，瘀血阻絡(luò)，心脈痹阻，而發(fā)生胸痛。芪蛭通脈顆粒正是根據(jù)瘀血阻絡(luò)的病因病機(jī)擬定的治療冠心病的經(jīng)驗(yàn)方，方中黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)，行滯通痹，為君藥；水蛭破血通泄，逐瘀力強(qiáng),三七活血化瘀而不傷正，兩者共為臣藥；紅曲健脾化痰，為佐藥；燈盞細(xì)辛活血通絡(luò)止痛，為使藥。全方共奏益氣活血、化瘀通絡(luò)之效。現(xiàn)代藥理研究亦表明，黃芪可提高免疫力，改善心功能，并有抗衰老作用[21]；水蛭有較強(qiáng)抗凝血作用[22]；三七主要含有人參皂苷和三七皂苷，具有降低心肌耗氧量、改善心肌氧利用率、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[23]；紅曲可加速膽固醇代謝，保護(hù)血管內(nèi)皮，改善內(nèi)皮功能[24]；燈盞細(xì)辛為云南民族藥，可以改善血液流動(dòng)，具有保護(hù)血管內(nèi)皮作用[25]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-8水平均升高(P<0.05)，IL-10水平降低(P<0.05)，冠狀動(dòng)脈組織TLR4、NF-κB相對(duì)表達(dá)升高(P<0.05)，提示模型組在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中出現(xiàn)明顯的炎性反應(yīng)，TLR4/NF-κB信號(hào)通路被激活，TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高。與模型組比較，芪蛭通脈中、高劑量組血清IL-6、IL-8水平均降低(P<0.05)，芪蛭通脈高劑量組IL-10水平升高(P<0.05)，芪蛭通脈低、中、高劑量組冠狀動(dòng)脈組織TLR4、NF-κB相對(duì)表達(dá)均降低(P<0.05)，阿托伐他汀鈣組僅NF-κB相對(duì)表達(dá)降低(P<0.05)，其中芪蛭通脈高劑量組對(duì)血清IL-6、IL-8水平改善均優(yōu)于芪蛭通脈低、中劑量組(P<0.05)。提示經(jīng)相應(yīng)灌胃治療后各組大鼠的炎性反應(yīng)和TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活情況均有一定抑制，其中芪蛭通脈高劑量組的治療效果更佳。

綜上所述，芪蛭通脈顆粒對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化大鼠治療作用確切，其作用機(jī)制可能與調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路，抑制炎性反應(yīng)有關(guān)，但其有效劑量及明確的量效關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。