吳夢(mèng)萍，王靚，張建華，張宏建，陳旭升*

1(江南大學(xué)，生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是一種天然均聚氨基酸，由25～35個(gè)L-賴氨酸(L-lysine,L-lys)單體通過α-COOH和ε-NH2脫水縮合而成[1]。作為一種廣譜的陽(yáng)離子抗菌肽，ε-PL可以破壞革蘭氏陽(yáng)性/陰性細(xì)菌、酵母菌等真菌的細(xì)胞包膜結(jié)構(gòu)，從而抑制微生物的生長(zhǎng)。目前，ε-PL已被日本、韓國(guó)、美國(guó)和中國(guó)等國(guó)家批準(zhǔn)作為食品防腐劑。此外，ε-PL具有良好的水溶性、對(duì)環(huán)境與人類無公害以及可生物降解性等極具商業(yè)價(jià)值的特性，因此被廣泛應(yīng)用于食療劑、干擾劑、酶保護(hù)劑、藥物載體等領(lǐng)域[2]。然而，作為一種主要由鏈霉菌生產(chǎn)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，ε-PL產(chǎn)量較低，限制了其工業(yè)化生產(chǎn)及商業(yè)應(yīng)用。

pH和溶解氧(dissolved oxygen, DO)是影響ε-PL發(fā)酵最主要的限制因素。一般來說，pH可以通過改變細(xì)胞膜的表面電荷來影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的有效性和酶活性，從而影響細(xì)胞活力[3]。KAHAR等[4]發(fā)現(xiàn)ε-PL產(chǎn)生的最適pH為4.0，而pH>5對(duì)細(xì)菌菌絲生長(zhǎng)更有利?；诖?，該團(tuán)隊(duì)建立了兩階段pH調(diào)控策略，將產(chǎn)量從5.7 g/L提高到48.3 g/L，提高了7.47倍。REN等[5]發(fā)現(xiàn)短時(shí)的酸性pH沖擊可以促進(jìn)菌體快速地生長(zhǎng)及ε-PL的大量合成，隨后建立了pH沖擊工藝，將ε-PL產(chǎn)量提高了52.5%，達(dá)到54.70 g/L。此外，由于ε-PL發(fā)酵為好氧發(fā)酵且發(fā)酵液的黏度較高，限制了DO在擴(kuò)大發(fā)酵時(shí)的傳遞效率。為了解決這個(gè)問題，XU等[6]在補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中，外源添加了氧載體(0.5%正十二烷)，提高了發(fā)酵液中DO濃度，將產(chǎn)量提高了31.6%。隨后，該團(tuán)隊(duì)通過過表達(dá)透明顫菌的血紅蛋白基因(vgb)，提高了StreptomycesalbulusPD-1發(fā)酵的氧氣攝取能力，將ε-PL提高至34.2 g/L，增加了50%[7]。然而，以往研究主要集中在ε-PL發(fā)酵前期(前36 h)對(duì)pH和DO的單獨(dú)優(yōu)化，很少有策略對(duì)pH與DO進(jìn)行同時(shí)優(yōu)化。

在前期的工作中，本團(tuán)隊(duì)經(jīng)過多輪誘變與核糖體工程選育，篩選出一株高產(chǎn)菌StreptomycesalbulusWG-608，其搖瓶ε-PL產(chǎn)量較出發(fā)菌提高了42.3%[8]。該菌株在發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期后，出現(xiàn)了葡萄糖消耗速度大幅下降、菌體生長(zhǎng)受到明顯抑制的現(xiàn)象，進(jìn)而影響了ε-PL的單位菌體合成能力?；诖?，本研究開發(fā)了一種新的pH-DO組合調(diào)控策略，分階段對(duì)pH和DO進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，顯著提高了WG-608的單位菌體合成能力與ε-PL產(chǎn)量。隨后，研究了WG-608的細(xì)胞生理變化，包括關(guān)鍵酶活性、呼吸鏈活性和胞內(nèi)核苷酸水平，以闡明pH-DO組合調(diào)控策略對(duì)細(xì)胞代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

StreptomycesalbulusWG-608由出發(fā)菌S.albulusM-Z18經(jīng)多輪誘變及核糖體工程獲得，并由本實(shí)驗(yàn)室保藏[9]。

1.1.2 培養(yǎng)基與溶液

種子發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖40，酵母粉8，(NH4)2SO45，K2HPO42，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，用NaOH調(diào)pH至7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60，酵母粉8，(NH4)2SO45，K2HPO42，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，消泡劑0.2，pH 6.8。

流加培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖750，氨水12.5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)，(NH4)2SO4375，消泡劑100。

100 mmol/L Tris-HCl：2.4228 g Tris和0.0308 g二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT, 1 mmol/L)溶于20%甘油并定容至200 mL,再用濃HCl調(diào)pH至7.5。

1.1.3 主要試劑與儀器

葡萄糖(優(yōu)級(jí)純)，山東西王藥業(yè)有限公司；酵母粉，Oxoid公司；其他試劑，均為分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；ATP、NAD(P)H試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；碘硝基氯化四氮唑藍(lán)(iodonitrotetrazolium chloride， INT)，上海源葉生物科技有限公司；BCA蛋白測(cè)定試劑盒，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

5 L發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備有限公司；UV-2100分光光度計(jì)，優(yōu)尼科儀器有限公司；AB204-N分析天平，瑞士梅特勒公司；GNP-9160恒溫培養(yǎng)箱，上海光都儀器設(shè)備有限公司；3K15高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；HYL-C組合式搖床，太倉(cāng)市強(qiáng)樂設(shè)備有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SM-650D超聲破碎儀，南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司；Biotek多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

一級(jí)種子液培養(yǎng)，取孢子接種于種子培養(yǎng)基，置于30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

二級(jí)種子液培養(yǎng)，將6.4 mL種子液接入含80 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)24 h。

5 L發(fā)酵罐ε-PL恒定pH補(bǔ)料分批發(fā)酵，在5 L罐中裝入3.2 L發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，設(shè)置發(fā)酵罐溫度30 ℃，初始轉(zhuǎn)速200 r/min，曝氣率1.14 vvm，pH 6.8，共發(fā)酵240 h。接種240 mL種子液入發(fā)酵罐，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵pH自然下降，當(dāng)pH降至4.0時(shí)，補(bǔ)加12.5%的氨水溶液將pH控制在4.0，直至發(fā)酵結(jié)束。通過調(diào)整轉(zhuǎn)速和通氣量，使DO盡量維持在30%，當(dāng)發(fā)酵液葡萄糖濃度<10 g/L時(shí)，根據(jù)葡萄糖的消耗速率設(shè)定補(bǔ)料速率，補(bǔ)加的葡萄糖溶液質(zhì)量濃度為750 g/L。當(dāng)罐內(nèi)的NH4+-N質(zhì)量濃度低于0.2 g/L時(shí)，補(bǔ)加375 g/L的(NH4)2SO4溶液，使其維持在0.1～0.5 g/L，直至發(fā)酵結(jié)束。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 發(fā)酵過程參數(shù)測(cè)定方法

葡萄糖濃度測(cè)定方法：將發(fā)酵液樣品離心后取一定量的上清液，使用生物傳感分析儀(biosensor analyzer，SBA)緩沖液稀釋100倍，充分混勻后進(jìn)行檢測(cè)并讀數(shù)；NH4+-N濃度測(cè)定方法：取發(fā)酵液離心后的上清液，稀釋一定比例后，通過靛酚藍(lán)反應(yīng)法測(cè)定[9]。發(fā)酵液的ε-PL濃度由甲基橙比色法測(cè)定[10]；菌體干重(dry cell weight, DCW)由濾紙差量法測(cè)定[11]。

1.2.2.2 生理參數(shù)測(cè)量

粗酶液的制備參照王靚[12]的方法加以改進(jìn)：取發(fā)酵液1 000×g離心5 min，棄上清液；0.2 g/L KCl溶液洗滌3次，棄上清液重懸于100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液；超聲破碎儀在60%功率下破碎細(xì)胞20 min(工作2 s，停2 s)，12 000×g離心20 min，上清液即為粗酶液，蛋白濃度測(cè)定參照BCA蛋白測(cè)定試劑盒。

酶活力測(cè)定方法：(1)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)活性測(cè)定參照TANG等[13]的方法并加以改進(jìn)，100 mmol/L Tris-HCl緩沖液350 μL，0.4 mmol/L NADP+18 μL，5 mmol/L葡萄糖-6-磷酸7 μL，粗酶液50 μL；定義1U為30 ℃條件下每分鐘1 μmol/L NADP+轉(zhuǎn)化為NADPH所需的酶量。(2)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)活性測(cè)定參照BRAMWELL等[14]的方法并加以改進(jìn)，100 mmol/L Tris-HCl緩沖液235 μL，1 mmol/L乙酰CoA 25 μL，40 mmol/L MnSO450 μL，100 mmol/L NaHCO350 μL，1.5 mmol/L NADH 50 μL，20 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸20 μL，500 U/mL蘋果酸脫氫酶10 μL，粗酶液10 μL，定義30 ℃條件下反應(yīng)1 min催化生成1 μmol NAD+所需的酶量為1個(gè)酶活力單位；(3)檸檬酸合酶(citrate synthase, CS)活力參照MURAKAMI等[15]的方法, 100 mmol/L Tris-HCl緩沖液235 μL，6.7 mmol/L 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)， DTNB] 10 μL，200 mmol/L草酰乙酸二鈉5 μL，1 mmol/L乙酰CoA 25 μL，定義30 ℃條件下反應(yīng)1 min催化生成1 μmol檸檬酸-CoA所需的酶量為1個(gè)酶活力單位；(4)天冬氨酸激酶(aspartokinase, AK)活力參照曾昕[17]的方法，3 mol/L pH 7.0鹽酸羥胺-KOH 50 μL，100 mmol/L ATP 50 μL，100 mmol/L MgSO450 μL，3 mol/L (NH4)2SO4100 μL，50 mmol/L天冬氨酸-KOH 40 μL，粗酶液50 μL。定義30 ℃條件下反應(yīng)1 min催化生成1 μmol天冬氨酰-β-羥肟所需的酶量為1個(gè)酶活單位；(5)PLS活性參考YAMANAKA等[16]的方法，100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)400 μL，100 mmol/LL-lys 100 μL，50 mmol/L ATP 100 μL，50 mmol/L MgCl2溶液100 μL，50 mmol/L DTT 100 μL，粗酶液200 μL，酶活定義為30 ℃條件下1 s催化減少1 pmolL-lys所需的酶量。

電子傳遞鏈的測(cè)量方法參照曾昕[17]的方法，在30 ℃條件下反應(yīng)，100 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl緩沖液60 μL，0.835 mmol/L NADH 15 μL，0.24 mmol/L NADPH 15 μL，0.133 mol/L丁二酸鈉 30 μL，1 g/L曲拉通30 μL，4 mmol/L INT 30 μL，粗酶液50 μL，測(cè)定490 nm處吸光度。細(xì)胞電子傳遞活性按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：φ，細(xì)胞電子傳遞鏈活性，μL O2/(h·g蛋白)；系數(shù)60可將反應(yīng)時(shí)間分鐘換算成小時(shí)；ΔA490，反應(yīng)時(shí)間內(nèi)的吸光度變化值；V總，反應(yīng)體系總體積，μL；1.42，INT接受O2電子比例；Δt，反應(yīng)時(shí)間，min；V酶，酶液加入量，μL；H液，反應(yīng)體系的光徑，nm。

ATP和輔因子測(cè)量：分別按照ATP檢測(cè)試劑盒、NADPH檢測(cè)試劑盒和NADH檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)2～3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用GraphPad prism 8.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)間的比較分析采用無交互作用的雙因數(shù)方差分析(Two-way ANOVA)中的Bonferroni’s檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)定為0.05；作圖采用OriginPro 9.1軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 S.albulus WG-608在恒定pH策略下的5 L罐發(fā)酵

在之前的研究中，經(jīng)多級(jí)誘變、基因組改組及核糖體工程育種獲得1株WG-608，其搖瓶的產(chǎn)量達(dá)到3.7 g/L，較出發(fā)菌M-Z18提高了48%[18]。在5 L罐中對(duì)WG-608進(jìn)行了恒定pH 4.0補(bǔ)料-分批發(fā)酵，并研究其發(fā)酵特性。

如圖1-a，pH在發(fā)酵10 h后快速下降，在24 h前降至pH 4.0，并維持至發(fā)酵結(jié)束。接種后DO快速下降，當(dāng)其降至30%左右，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量將其維持在30%左右。

a-ε-PL發(fā)酵過程情況；b-ε-PL日增長(zhǎng)量、 菌體日增長(zhǎng)量和葡萄糖日消耗量圖1 恒定pH補(bǔ)料-分批發(fā)酵Fig.1 Constant pH fed-batch fermentation

在整個(gè)發(fā)酵過程中，葡萄糖的質(zhì)量濃度維持在1～10 g/L，以避免底物抑制。觀察到葡萄糖的消耗速度在0～72 h快速增加，而72 h后開始顯著下降。與之對(duì)應(yīng)，菌體干重在前72 h內(nèi)達(dá)到了39.57 g/L，而在72～240 h之間僅增長(zhǎng)了9.59 g/L(圖1-b)。ε-PL在整個(gè)發(fā)酵過程中持續(xù)快速積累，這意味著ε-PL屬于生長(zhǎng)半耦聯(lián)型產(chǎn)物，其產(chǎn)量既受菌體的生長(zhǎng)影響，還與菌體質(zhì)量濃度相關(guān)。經(jīng)240 h的補(bǔ)料分批發(fā)酵，ε-PL達(dá)到(53.63±0.78) g/L。

以上結(jié)果表明，發(fā)酵后期(72 h后)WG-608的底物葡萄糖消耗與菌株生長(zhǎng)均受到了強(qiáng)烈抑制。發(fā)現(xiàn)ε-PL的合成受pH 和DO的影響十分顯著，故將發(fā)酵過程劃分為2個(gè)階段，即菌體生長(zhǎng)期(0～72 h)和產(chǎn)物合成期(72～240 h)。通過對(duì)pH和DO的系統(tǒng)優(yōu)化，探索每個(gè)發(fā)酵階段最適合的發(fā)酵條件，以期進(jìn)一步提高WG-608的ε-PL合成能力。

2.2 pH對(duì)S.albulus WG-608發(fā)酵ε-PL的影響

研究表明，ε-PL僅在酸性培養(yǎng)條件下大量積累[16]，但pH過低會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)[19]。為了確定pH對(duì)高產(chǎn)菌WG-608生產(chǎn)ε-PL的影響，將pH分別控制在3.7、4.0、4.3和4.6，于5 L發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行了72 h的補(bǔ)料分批發(fā)酵。如表1所示，pH值對(duì)菌體干重和ε-PL產(chǎn)量有顯著影響。隨著pH值的增加，菌體量逐漸增加，與KAHAR等[4]的結(jié)果類似。當(dāng)pH為4.0時(shí)，ε-PL的產(chǎn)量達(dá)到最大值16.65 g/L，分別比pH 3.7，4.3和4.6提高了11.1%、10.9%、33.4%。此外，較低(3.7)或較高的pH(4.6)均不利于ε-PL的生產(chǎn)。這可能是由于當(dāng)pH維持在3.7發(fā)酵時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制(平均比生長(zhǎng)速率最低)，進(jìn)而限制了ε-PL的合成。pH 4.6時(shí)，底物的消耗主要用于菌體的快速積累，此時(shí)ε-PL的產(chǎn)量和單位菌體合成能力最低，分別為12.48 g/L和0.57 g/g。

表1 不同pH條件下WG-608生產(chǎn)ε-PL的情況Table 1 Comparison of ε-PL production by S.albulus WG-608 under different pH levels

在ε-PL發(fā)酵中，pH 4.0有利于胞內(nèi)大量積累ATP，進(jìn)而激活ε-PL合成酶的表達(dá)及調(diào)節(jié)其催化功能[16, 20]。然而，長(zhǎng)時(shí)間的酸性環(huán)境導(dǎo)致ATP被大量消耗用以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，不利于菌絲體的生長(zhǎng)，繼而影響ε-PL的合成[4, 21]。本研究發(fā)現(xiàn)雖然WG-608在pH 4.0時(shí)ε-PL濃度達(dá)到最大值，但其實(shí)pH 4.0與4.3條件下的菌體量、產(chǎn)量和單位菌體合成能力相差不大(表1)。鑒于pH 4.3時(shí)菌株表現(xiàn)出更強(qiáng)的菌體生長(zhǎng)能力，因此選擇在72 h后(發(fā)酵穩(wěn)定期)將pH維持在4.3，以緩解酸性環(huán)境對(duì)菌體生長(zhǎng)和ε-PL合成造成的不利影響[12]

2.3 DO對(duì)ε-PL補(bǔ)料分批發(fā)酵的影響

小白鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL屬于好氧發(fā)酵，發(fā)酵罐內(nèi)的DO水平對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)量都有顯著影響[6]。一般來說，發(fā)酵液中較高的DO條件有利于增強(qiáng)碳源的利用效率，增大碳代謝通量，從而提高發(fā)酵生產(chǎn)效率[22]。然而過量的DO水平也可能會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧的過量積累，從而引起細(xì)胞氧化應(yīng)激作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞提早衰亡[23]。對(duì)于生物發(fā)酵過程，其不同階段的最適DO存在差異，因此在不同的發(fā)酵階段按需供氧顯得十分必要[24]。

根據(jù)2.1中WG-608的恒定pH發(fā)酵特征，將240 h發(fā)酵過程中的DO分為2個(gè)階段進(jìn)行優(yōu)化，即菌體生長(zhǎng)期(0～72 h)和產(chǎn)物合成期(72～240 h)。

2.3.1 DO對(duì)菌體生長(zhǎng)期ε-PL發(fā)酵的影響

在pH 4.0的條件下，將發(fā)酵罐內(nèi)DO分別控制在20%、30%、40%，于5 L罐內(nèi)進(jìn)行72 h的分批-補(bǔ)料發(fā)酵。結(jié)果表明，DO維持在40%時(shí)，產(chǎn)量和DCW均達(dá)到最高，分別為19.30和39.77 g/L(表2)。說明該階段ε-PL合成的最適DO為40%。因此，選擇40%的DO水平作為菌體生長(zhǎng)期的最適DO。

表2 菌體生長(zhǎng)期DO對(duì)WG-608 ε-PL 產(chǎn)量的影響Table 2 Effect of dissolved oxygen on ε-PL production by S.albulus WG-608 during the growth period

2.3.2 DO對(duì)產(chǎn)物合成期ε-PL發(fā)酵的影響

基于2.3.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將0～72 h的DO控制在40%，將72 h后的DO分別維持在10%、20%、30%，以探索發(fā)酵后期DO對(duì)ε-PL發(fā)酵的影響。圖2表明，將發(fā)酵后期的DO控制于20%，菌體量和產(chǎn)量均達(dá)到最高，分別達(dá)到57.13 和66.24 g/L。因此在產(chǎn)物合成期確定DO控制于20%更有利于小白鏈霉菌生產(chǎn)ε-PL。

a-菌體干重(DCW)；b-ε-PL產(chǎn)量圖2 不同DO條件下WG-608產(chǎn)物合成期生產(chǎn)ε-PLFig.2 ε-PL production by S.albulus WG-608 under different dissolved during the production synthesis period

2.4 pH-DO組合調(diào)控策略的建立

綜合上述結(jié)果，建立了pH-DO組合調(diào)控策略。整個(gè)策略分為2個(gè)階段，第一階段(0～72 h)，pH從6.8自然下降并維持在4.0，同時(shí)DO從初始的100%下降并維持在40%；第二階段(72～240 h)，DO控制在20%，pH控制于4.3。圖3-a顯示，經(jīng)pH-DO組合策略調(diào)控，WG-608的DCW在72 h經(jīng)短暫的停滯后，持續(xù)增長(zhǎng)，這與原始策略顯然有很大的不同(圖1)。隨著菌體生長(zhǎng)速率的增加，ε-PL的產(chǎn)量積累明顯高于對(duì)照策略。最終經(jīng)240 h的發(fā)酵，ε-PL產(chǎn)量與平均比合成速率分別可達(dá)(68.77±2.53) g/L和(2.33±0.08) d-1，較原始策略分別提升了28.23%和12.02%(表3)。

表3 不同策略對(duì)WG-608生產(chǎn)ε-PL的影響Table 3 Effect of ε-PL production by S.albulus WG-608 under different fermentation strategy

a-ε-PL發(fā)酵過程情況；b-菌體比生長(zhǎng)速率；c-ε-PL比合成速率；d-葡萄糖消耗量圖3 pH-DO組合策略生產(chǎn)ε-PLFig.3 The ε-PL production by pH-DO combination strategy注:圖中相同時(shí)段恒定pH和pH-DO組合調(diào)控策略之間的差異，以*表示0.01

圖3-b顯示，在0～72 h，pH-DO組合調(diào)控策略的日平均比生長(zhǎng)速率顯著高于對(duì)照策略，而72 h后2種策略之間無顯著差異。而對(duì)于日平均比合成速率而言，pH-DO組合調(diào)控策略則在72 h后(除168 h)顯現(xiàn)出了明顯優(yōu)勢(shì)。此外，對(duì)2種策略下2個(gè)階段葡萄糖的消耗總量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖3-d)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵第一階段(0～72 h)的2種策略下的葡萄糖消耗總量無顯著差異，而第二階段(72～240 h)，pH-DO組合調(diào)控策略的糖耗較原始策略顯著提高，由315.5 g/L增長(zhǎng)到528.8 g/L，增加了67.6%，葡萄糖轉(zhuǎn)化率也提高了6.7%。以上結(jié)果說明，pH-DO組合調(diào)控策略主要通過前期增加單位菌體的合成速率，而后期增加對(duì)葡萄糖的消耗和單位菌體合成能力，最終提高了WG-608的ε-PL產(chǎn)量。

HUANG等[3]探究了菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的pH和DO差異的分析，發(fā)現(xiàn)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的最佳pH和DO存在差異，因此建立了2階段pH和DO控制策略，將菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成分為2個(gè)階段進(jìn)行調(diào)控，最終使MortierellaalpinaCCFM698的總脂肪酸和二十碳五烯酸的產(chǎn)量提高了10.7%和26.6%，與本文研究結(jié)果相似。盡管如此，pH-DO組合調(diào)控提高ε-PL產(chǎn)量的原因仍不清楚。

2.5 pH-DO組合調(diào)控發(fā)酵提高產(chǎn)量機(jī)制初探

2.5.1 pH-DO組合策略對(duì)ε-PL合成途徑的關(guān)鍵酶活性的影響

2.4中分析了2種策略的基本發(fā)酵參數(shù)的差異，發(fā)現(xiàn)經(jīng)pH-DO組合調(diào)控策略，WG-608對(duì)底物消耗顯著增加，推測(cè)該策略可能通過影響ε-PL的合成代謝，提高了對(duì)底物的攝取和利用。L-lys是ε-PL合成途徑中的唯一前體，據(jù)報(bào)道，用于L-賴氨酸合成的碳骨架主要通過糖酵解途徑、回補(bǔ)反應(yīng)、磷酸戊糖(pentose phosphate, PP)途徑和三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)提供。因此，對(duì)不同發(fā)酵時(shí)期的4種關(guān)鍵酶，PEPC、G6PDH、CS、AK的活性進(jìn)行檢測(cè)和分析，以進(jìn)一步了解pH-DO組合調(diào)節(jié)對(duì)ε-PL合成和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

G6PDH是糖酵解途徑進(jìn)入磷酸戊糖途徑(PP途徑)的關(guān)鍵限速酶，其活性決定了PP途徑代謝通量的大小。由圖4-a可知G6PDH的活性在48 h顯著提高，在其余時(shí)段也相對(duì)更高，這與2.4中在DO 40%期間比生長(zhǎng)速率顯著提高一致。說明在pH-DO調(diào)控策略下，流入PP途徑的碳通量明顯增加，為WG608菌體的生長(zhǎng)與L-lys的合成提供了更多的戊糖和NADPH。對(duì)胞內(nèi)NADPH水平的檢測(cè)也印證了這一推測(cè)(圖5-a)。由于在pH-DO組合調(diào)控策略下細(xì)胞生長(zhǎng)更好，PP途徑的增強(qiáng)似乎是一種對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)需求的響應(yīng)。

a-G6PDH；b- PEPC；c-CS；d- AK；e-PLS圖4 pH-DO組合策略與恒定pH策略下關(guān)鍵酶活性的比較Fig.4 Comparison of key enzyme activities of metabolic pathways with pH-DO strategy and constant pH strategy

TCA循環(huán)是能量代謝的中樞，也是細(xì)胞提供ATP和FADH2的主要途徑。CS是草酰乙酸進(jìn)入TCA循環(huán)的第一個(gè)酶。圖4-c可知，隨發(fā)酵的進(jìn)行，2種策略中的CS的變化趨勢(shì)基本一致。96 h后pH-DO策略中的CS活性顯著提高，這可能驅(qū)動(dòng)TCA循環(huán)產(chǎn)生更多的 NADH 和 FADH2，并通過呼吸鏈和氧化磷酸化途徑合成更多的ATP。此外，增強(qiáng)的TCA循環(huán)可以為L(zhǎng)-lys的生物合成提供更多的前體草酰乙酸(oxaloacetic acid, OAA)。TCA循環(huán)的許多其他中間代謝物，如檸檬酸和α-酮戊二酸，也是碳水化合物、脂質(zhì)或氨基酸生物合成的重要前體?？傊琾H-DO策略增強(qiáng)了TCA循環(huán)的代謝通量，為快速合成ε-PL和菌體量補(bǔ)充了足夠的能量和前體。

回補(bǔ)反應(yīng)是PPC(PEP+CO2+ADP→OAA)補(bǔ)充OAA消耗的另一個(gè)重要途徑。從圖4-b可以看出，pH-DO組合調(diào)控策略中，PPC的活性高于對(duì)照組，可以為L(zhǎng)-lys的合成回補(bǔ)更多的OAA前體。AK是L-賴氨酸生物合成中的關(guān)鍵酶。96 h后pH-DO策略中的AK活性也明顯更高(圖4-d)，表明pH-DO的組合調(diào)節(jié)明顯增強(qiáng)了L-賴氨酸合成途徑的代謝通量，從而促進(jìn)了L-lys和ε-PL的合成。

PLS在2種發(fā)酵工藝中的變化趨勢(shì)較為一致，在96 h前逐漸升高至最大值，隨后開始降低。然而，pH-DO組合調(diào)控策略的發(fā)酵后期酶活力仍保持著相對(duì)較高的活力，這與2.4中產(chǎn)物比合成速率的趨勢(shì)較為一致，PLS在后期保持著較高水平的酶活力，這可能是pH-DO策略下發(fā)酵后期的比合成速率更高的原因。以上結(jié)果表明，經(jīng)過pH-DO組合調(diào)控策略通過增強(qiáng)WG-608在整個(gè)發(fā)酵過程中的代謝活力和碳代謝通量，促進(jìn)細(xì)胞攝取了更多的底物，以提高ε-PL的產(chǎn)量。

2.5.2 pH-DO組合策略對(duì)胞內(nèi)輔因子的影響

大量研究證明，NAD(P)H是胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)的重要輔因子，有利于胞內(nèi)氧化還原的平衡，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和NAD(P)H依賴性產(chǎn)物的合成，而1分子的L-lys的合成就需要消耗4當(dāng)量的NADPH[25]。此外，PLS在利用前體L-lys合成ε-PL的過程中需要消耗大量ATP，且高濃度的ATP可以激活PLS的活性[16]。因此，胞內(nèi)輔因子的濃度對(duì)L-lys與ε-PL的合成具有很大影響。在2.5.1的結(jié)果中，通過檢測(cè)代謝途徑的關(guān)鍵酶活性，推測(cè)pH-DO組合策略可能增大了碳代謝通量，但其對(duì)胞內(nèi)輔因子帶來的影響，還需進(jìn)一步評(píng)估。

大多數(shù)胞內(nèi)ATP是通過呼吸鏈和氧化磷酸化產(chǎn)生的。由圖5-a的電子傳遞鏈強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，pH-DO組合調(diào)控策略的電子傳遞能力更高，基本達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，電子傳遞過程耦合了ATP的形成，表明ATP的合成能力在pH-DO策略中也被增強(qiáng)了。由圖5-b中可知，pH-DO組合調(diào)控策略中的胞內(nèi)ATP濃度在整個(gè)發(fā)酵過程中呈下降的趨勢(shì)。而在恒定發(fā)酵過程中，ATP在前96 h下降，但96 h后卻開始積累。同時(shí)，96 h后，pH-DO組合調(diào)控策略中的胞內(nèi)ATP濃度顯著低于對(duì)照組，這與預(yù)期截然相反。結(jié)合PLS活性在96 h 后仍保持著較高水平的情況，推測(cè)由于PLS的活性增強(qiáng)，大量合成的ε-PL增加了胞內(nèi)ATP的消耗，以致最終胞內(nèi)ATP濃度較低。

a-電子呼吸鏈；b-ATP；c-NADH；d-NAD+/NADH；e-NADPH；f-NADP+/NADPH圖5 發(fā)酵過程中生理參數(shù)比較Fig.5 Comparison of Physiological Parameters in Fermentation Processes

如圖5-c和圖5-d所示，2種策略中的胞內(nèi)NADH水平呈波動(dòng)變化，且pH-DO組合調(diào)控策略中的NADH水平基本高于對(duì)照。類似，NAD+/NADH的比值略微高于對(duì)照，說明pH-DO策略提高了NADH的利用率。pH-DO組合調(diào)控策略中NADPH水平在48和96 h時(shí)高于對(duì)照組，而在168和240 h低于對(duì)照，而NADPH的利用率(NADP+/NADPH)與上述結(jié)果恰恰相反。結(jié)合2.4的結(jié)果，推測(cè)雖然pH-DO調(diào)控策略增強(qiáng)了NADPH的供應(yīng)量，但由于發(fā)酵后期NADPH被大量用于L-lys的合成，導(dǎo)致胞內(nèi)實(shí)際NADPH水平下降。

綜合上述結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)pH-DO組合調(diào)控策略在提高胞內(nèi)ATP、NADH和NADPH合成代謝的同時(shí)，也增強(qiáng)了其分解代謝。總的來說，經(jīng)pH-DO調(diào)控，胞內(nèi)總體代謝活力更強(qiáng)，為ε-PL和菌體的合成提供了更多的前體或中間代謝物。

3 結(jié)論

本研究表明，根據(jù)ε-PL高產(chǎn)菌S.albulusWG-608對(duì)發(fā)酵條件的需求，在發(fā)酵的不同階段對(duì)pH和DO進(jìn)行不同控制，可以顯著提高S.albulusWG-608的ε-PL合成能力。采用新建立的pH-DO組合調(diào)控策略進(jìn)行240 h的補(bǔ)料分批發(fā)酵后，WG-608的ε-PL產(chǎn)量和平均比合成速率達(dá)到68.77 g/L和2.33 d-1，比對(duì)照組(48.19 g/L和2.08 d-1)分別提高了28.33%和12.02%。進(jìn)一步探究表明，該策略通過增強(qiáng)中心碳代謝途徑、L-lys與ε-PL合成途徑關(guān)鍵酶活性，增強(qiáng)WG-608對(duì)底物的攝取能力以及底物朝向ε-PL的代謝通量，最終提高了ε-PL的產(chǎn)量與比合成速率。胞內(nèi)輔因子NADH、ATP與NADPH的合成增強(qiáng)，為L(zhǎng)-lys與ε-PL的合成提供了足夠的還原力和能量。本研究所獲得的結(jié)果有助于ε-PL的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。此外，由于pH-DO組合調(diào)控策略下ε-PL大量合成，促使游離胞內(nèi)輔因子(ATP和NADPH)的含量大幅降低，有可能出現(xiàn)供不應(yīng)求的狀態(tài)。因此，后期可以考慮利用代謝工程手段提高胞內(nèi)輔因子的供應(yīng)量和利用率，以期進(jìn)一步提高小白鏈霉菌ε-PL的生產(chǎn)效率。