段小云，仲瑞雪，吳傳紅，季 歐(四川省骨科醫(yī)院藥學(xué)部，成都 610041)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)屬于骨代謝性疾病，可導(dǎo)致骨量降低及骨組織微結(jié)構(gòu)破壞[1-2]。該病與年齡增長(zhǎng)緊密相關(guān)，隨著我國(guó)老齡人口不斷增加，OP已成為我國(guó)面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一[3]。中醫(yī)學(xué)中并未收載“骨質(zhì)疏松癥”的病名，根據(jù)OP的病理機(jī)制及臨床表現(xiàn)，將其歸屬為中醫(yī)“骨痿”范疇[4]。因“腎主身之骨髓”，其病變?cè)诠?，但其本在腎，又因OP多由肝腎虧虛的“虛”所致，目前臨床上中醫(yī)藥治療OP多以補(bǔ)腎壯骨類藥物為主，中醫(yī)藥防治OP具有臨床療效好、不良反應(yīng)小等優(yōu)勢(shì)，具有廣泛的應(yīng)用前景[5-6]。本研究對(duì)中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)中收錄的中醫(yī)藥治療OP的方劑進(jìn)行檢索及梳理，挖掘中醫(yī)藥用藥規(guī)律，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。

1 資料與方法

1.1 處方來源與篩選

以“中藥”“中醫(yī)”“骨質(zhì)疏松”和“骨痿”等為檢索詞，在CNKI中進(jìn)行檢索，時(shí)間設(shè)定為2015—2022年，參照《中國(guó)人骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)專家共識(shí)(第三稿·2014版)》[7]和《內(nèi)科學(xué)》(第2版)[8]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，剔除異名同藥方劑及外用藥方，篩選出藥味、劑量完整的有效處方104張。

1.2 分析平臺(tái)

采用“中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)(V2.5)”，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所研發(fā)。

1.3 藥物命名

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)，對(duì)104張有效處方中藥物名稱進(jìn)行梳理、規(guī)范。如將“破故紙”規(guī)范為“補(bǔ)骨脂”，“仙靈脾”改為“淫羊藿”等，雙人核對(duì)錄入。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

運(yùn)用軟件的“數(shù)據(jù)分析”選項(xiàng)下“頻次統(tǒng)計(jì)”“組方規(guī)律”及“新方分析”等不同功能，挖掘處方中的用藥規(guī)律，如使用頻次、關(guān)聯(lián)規(guī)則及新方組合等。

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)篩選有效成分及靶點(diǎn)，與從GeneCards等數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出OP的靶點(diǎn)相交，獲得治療OP的潛在靶點(diǎn)。將上述靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物使用頻次分析

104張有效處方中共涉及135味中藥，使用總頻次為1 164次，進(jìn)行藥物使用頻次分析。結(jié)果顯示，使用頻次≥30次的藥物有69味，排序居前3位的藥物分別為熟地黃、淫羊藿和當(dāng)歸，見表1。

表1 104張?zhí)幏街惺褂妙l次≥30次的藥物Tab 1 Drugs with application frequency ≥ 30 times in 104 prescriptions

2.2 藥物的歸經(jīng)分布

治療OP常用藥物多歸肝、腎及脾經(jīng)，見表2。

表2 104張?zhí)幏街兴幬餁w經(jīng)分析Tab 2 Analysis of meridian tropism in 104 prescriptions

2.3 組方規(guī)律

對(duì)數(shù)據(jù)實(shí)施預(yù)處理后，將支持度設(shè)定為30，置信度個(gè)數(shù)設(shè)定為0.70[9-10]，得到常見的藥物組合。其中“熟地黃→淫羊藿”“熟地黃→當(dāng)歸”及“淫羊藿→補(bǔ)骨脂”居前3位，見表3—4。通過網(wǎng)絡(luò)化展示其關(guān)聯(lián)規(guī)律，其中熟地黃、淫羊藿等居于網(wǎng)絡(luò)圖中心位置，與常用藥物組合吻合，見圖1。

表3 104張?zhí)幏街械乃幬锝M合Tab 3 Medicine flavor combination in 104 prescriptions

表4 104張?zhí)幏街兴幬锝M合關(guān)聯(lián)規(guī)則(置信度≥0.70)Tab 4 Medicine flavor combination association rule in 104 prescriptions (confidence≥0.70)

圖1 關(guān)聯(lián)規(guī)則網(wǎng)絡(luò)化展示(支持度≥28.85% ，置信度≥0.70)Fig 1 Network display of association rules (support ≥28.85%, confidence ≥0.70)

2.4 常用組合分析

設(shè)相關(guān)度=7，懲罰度=2，基于復(fù)雜系統(tǒng)熵的聚類分析[9-10]，得到藥物的常用組合，見表5。

表5 基于復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類分析的常用組合Tab 5 Complex systems common combinations based on entropy cluster

2.5 新方分析

通過核心藥物組合，進(jìn)行新方藥物組合分析，選擇“聚類”項(xiàng)下提取新方組合，共推薦18個(gè)可供選擇的新方藥物組合，進(jìn)一步選擇“聚類”選項(xiàng)，篩選后得到推薦的9個(gè)新方，見表6—7；并得出新方組合的網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖，見圖2。

圖2 中醫(yī)治療OP的新方組合Fig 2 New prescription combination of traditional Chinese medicine in the treatment of OP

表6 新方聚類的核心組合分布Tab 6 Core combination distribution of new square clustering

表7 基于熵層次聚類的潛在新方組合Tab 7 Potential new party combination based on entropy hierarchical clustering

2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制研究

2.6.1 藥物活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選：通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索熟地黃、淫羊藿、當(dāng)歸、牛膝及黃芪的化合物成分(設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18)及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，再經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)校正，去掉非人類靶點(diǎn)。經(jīng)匯總刪重后，獲得熟地黃2個(gè)化合物成分，30個(gè)靶點(diǎn)；獲得淫羊藿23個(gè)化合物成分，208個(gè)靶點(diǎn)；獲得當(dāng)歸2個(gè)化合物成分，51個(gè)靶點(diǎn)；獲得牛膝20個(gè)化合物成分，199個(gè)靶點(diǎn)；獲得黃芪20個(gè)化合物成分，194個(gè)靶點(diǎn)。

2.6.2 藥物-疾病共同靶點(diǎn)交集：以“OP”為關(guān)鍵詞，在人類基因綜合分析數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards)、美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)及人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM)進(jìn)行人類基因檢索，刪重后得到OP相關(guān)基因共2 374個(gè)。將藥物與疾病靶點(diǎn)輸入Venny 2.1軟件，得到109個(gè)共有靶點(diǎn)，見圖3。

圖3 藥物-疾病交集靶點(diǎn)韋恩圖Fig 3 Wayne diagram of drug-disease intersection target

2.6.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建：將109個(gè)共有靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)為“Homo sapiens”，得到109個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 592條邊，平均度值為29.2，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。通過Network Analyzer工具按度值排序，共篩選出49個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，繪制前20靶點(diǎn)條形圖，見圖5。

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 4 PPI network of key targets

圖5 關(guān)鍵靶點(diǎn)信息條形圖Fig 5 Information bar diagram of key targets

2.6.4 成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：通過Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。

六邊形代表中藥；棱形代表活性成分；長(zhǎng)方形代表疾??；圓形代表疾病靶點(diǎn)hexagons represent traditional Chinese medicine；prisms represent active ingredients；rectangles represent diseases；circles represent disease targets圖6 成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig 6 Component-disease target network

2.6.5 GO功能富集分析：引用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，以P<0.05進(jìn)行篩選，得到1 939條生物過程(BP)、118項(xiàng)分子功能(MF)和42項(xiàng)細(xì)胞組成(CC)，見圖7。

圖7 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因生物功能注釋信息柱狀圖Fig 7 Biological function annotation information of key targets

2.6.6 KEGG通路富集分析：引用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，以P<0.05進(jìn)行篩選，得到159條信號(hào)通路，見圖8。

圖8 關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG通路富集分析Fig 8 KEGG pathway enrichment analysis of key targets

2.6.7 成分-疾病-通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：將成分-疾病-通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，繪制通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖9。

六邊形代表中藥；棱形代表化合物；長(zhǎng)方形代表疾病；圓形代表疾病靶點(diǎn)；三角形代表信號(hào)通路hexagons represent traditional Chinese medicine；prisms represent compounds；rectangles represent diseases；circles represent disease targets；triangles represent signaling pathways圖9 成分-疾病-通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig 9 Component-disease-pathway-target network

3 討論

3.1 藥物使用頻次分析

本研究納入近年來中醫(yī)藥治療OP的方劑104張，包括135味中藥，其中使用頻次≥30次的中藥有14味。中醫(yī)治療OP以補(bǔ)益肝腎為主，居前3位的藥味為熟地黃(66次)、淫羊藿(65次)及當(dāng)歸(52次)，“熟地黃→淫羊藿”組合出現(xiàn)頻次最高，熟地黃擅補(bǔ)腎陰，淫羊藿擅補(bǔ)腎陽(yáng)，二藥配伍，增強(qiáng)了補(bǔ)腎壯骨的功效。而“山藥→熟地黃”組合的關(guān)聯(lián)性最高。山藥具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、補(bǔ)腎澀精的功效，與熟地黃配伍應(yīng)用，又具有收斂的作用，可滋陰益精，大補(bǔ)元?dú)?。采用層次聚類分析，共得?個(gè)新方劑。

3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過TCMSP、UniProt和GeneCards等數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合Cytoscape軟件研究核心藥對(duì)治療OP的內(nèi)在機(jī)制。核心藥對(duì)與疾病的前10位共同靶點(diǎn)分別為白介素6(IL-6)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt1)、白介素1β(IL-1β)、宿主的原癌基因(JUN)、環(huán)氧合酶2(PTGS2)、半胱氨酸肽酶3(CASP3)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、雌激素受體1(ESR1)、原癌基因(FOS)和纖維連接蛋白1(FN1)。IL-6是促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖分化的重要因子[11]。淫羊藿苷通過降低骨質(zhì)疏松模型小鼠骨組織中IL-6的表達(dá)，抑制骨質(zhì)吸收，產(chǎn)生抗OP的作用[12-13]。Akt1屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，激活A(yù)kt1可發(fā)揮多種生物效應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、代謝及血管生成等[14]；同時(shí)，可調(diào)控成骨分化和破骨分化[15]。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅玫胶诵乃帉?duì)治療OP的主要活性成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素和漢黃芪素等。槲皮素屬于黃酮類化合物，能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞生成[16]，提高大鼠骨密度[17]。山柰酚屬于黃酮醇，能抑制破骨細(xì)胞的骨吸收和促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化[18-19]。木犀草素能抑制氧化應(yīng)激，促進(jìn)細(xì)胞增殖及成骨細(xì)胞的分化[20]；同時(shí)，通過減少破骨細(xì)胞分化和降低骨吸收功能來預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[21]。GO及KEGG富集結(jié)果顯示，“熟地黃-當(dāng)歸-牛膝-黃芪-淫羊藿”核心藥對(duì)治療OP的生物過程有氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)及對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)，分子功能涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合及信號(hào)受體激活劑活性等；涉及的主要信號(hào)通路包括晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-AGE受體(RAGE)、脂質(zhì)動(dòng)脈粥樣化、IL-17信號(hào)通路及腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路等。

綜上所述，槲皮素、木犀草素和山柰酚等為治療OP的重要有效成分，可通過作用于IL-6、Akt1和IL-1β等關(guān)鍵靶點(diǎn)，參與AGE-RAGE、脂質(zhì)動(dòng)脈粥樣化、IL-17信號(hào)通路及TNF信號(hào)通路等達(dá)到治療OP的作用。本研究運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法為臨床治療OP提供了可借鑒的中藥配伍，為下一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定了理論基礎(chǔ)。