陳曉晨 杜希萍,2,3,4 周莉鵑 伍 菱,2,3,4 李志朋,2,3,4 楊遠帆,2,3,4

(1. 集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2. 福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；3. 廈門市食品與生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021；4. 廈門南方海洋研究中心海藻資源化利用與深加工重點實驗室，福建 廈門 361021)

壇紫菜(Porphyrahaitanensis)屬紅藻類紅毛菜科，是中國重要的大型經(jīng)濟海藻，廣泛種植于福建、浙江和廣東等沿海城市，年產(chǎn)量占全國70%以上[1-2]。壇紫菜的產(chǎn)量較大、生長周期較長，具有“分茬”采收的特點，首次采收的紫菜稱作“頭水壇紫菜”，之后依次稱作二水、三水壇紫菜等。據(jù)報道[3]，不同海域和不同采收期的壇紫菜在蛋白質(zhì)、脂肪、灰分等營養(yǎng)物質(zhì)方面均存在一定的差異，頭水壇紫菜的營養(yǎng)價值最高，口感最好，售價也最高[4]。隨著采收期的延長，壇紫菜的營養(yǎng)價值降低，口感變差，商業(yè)價值降低，常被養(yǎng)殖戶遺棄，造成環(huán)境污染和資源浪費[5]。因此，對采收后期壇紫菜的應(yīng)用和開發(fā)受到國內(nèi)廣大研究者的關(guān)注[6]。

壇紫菜多酚具有抗氧化、抑菌、降血糖和抗腫瘤等多種活性功能[7]。α-葡萄糖苷酶是一種位于小腸黏膜上的水解酶，能夠?qū)⒍寝D(zhuǎn)化成能被小腸吸收的單糖，從而引發(fā)餐后血糖升高。研究表明，多酚可以通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性[8-9]，延遲碳水化合物的分解和葡萄糖的吸收，從而有效調(diào)節(jié)糖尿病患者餐后血糖的濃度[10]。除此之外，多酚類化合物還可以通過清除自由基發(fā)揮降血糖作用，通過抑制機體的氧化反應(yīng)，讓自由基維持在穩(wěn)定狀態(tài)，保護機體免受氧化損傷[10]。目前，不同采收期壇紫菜多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制活性、抗氧化作用的研究尚未見報道。

研究擬以壇紫菜為原料，采用超聲波輔助法提取壇紫菜多酚，研究乙醇體積分數(shù)、超聲時間、液料比3個因素對多酚提取的影響，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化壇紫菜多酚的提取工藝條件，進一步研究不同采收期壇紫菜的多酚含量及對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用和抗氧化作用，以期為不同采收期壇紫菜在天然降血糖食品及抗氧化劑領(lǐng)域的高值化利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壇紫菜干制品(頭水、二水、三水和四水)：市售；

α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-葡萄糖苷(p-NPG)：美國Sigma公司；

沒食子酸、無水乙醇、福林酚、2,2’-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)：國藥集團化學試劑有限公司；

2,2’-偶氮二異丁基咪二鹽酸鹽(AAPH)、水溶性維生素E(Trolox)、熒光素鈉、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：上海源葉生物科技有限公司；

無水碳酸鈉：西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速萬能粉碎機：JP-500C型，鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司；

電子天平：EL104型，梅特勒托利多科技(中國)有限公司；

高頻率數(shù)控超聲波清洗器：KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

高速冷凍離心機：5810R型，艾本德中國有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-Ⅲ型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

微孔板恒溫振蕩器：TS200型，杭州瑞誠儀器有限公司；

微孔板分光光度計：Epoch2T型，美國伯騰儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 壇紫菜多酚提取 將壇紫菜用粉碎機粉碎，過60目篩，干燥避光保存?zhèn)溆?。準確稱取1 g壇紫菜粉末，按一定液料比加入一定體積分數(shù)的乙醇溶液，在超聲功率800 W條件下提取一段時間，8 000 r/min離心20 min，上清液即為壇紫菜多酚提取液，提取3次。低壓真空濃縮除去乙醇溶劑，濃縮液冷凍干燥，得到壇紫菜多酚樣品，-20 ℃貯藏備用。

1.3.2 單因素試驗 按照1.3.1的提取方法，以液料比[V乙醇溶液∶m壇紫菜分別為30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，70∶1 (mL/g)]、乙醇體積分數(shù)(40%，50%，60%，70%，80%)、超聲時間(30，40，50，60，70 min)為考察因素，以多酚含量為指標，探索最適的壇紫菜多酚提取條件。

1.3.3 響應(yīng)面試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，優(yōu)化超聲波輔助提取壇紫菜多酚的工藝參數(shù)。

1.3.4 壇紫菜多酚含量測定 采用Folin法[7]，根據(jù)標準曲線回歸方程和式(1)計算壇紫菜的多酚含量(以沒食子酸計)。

(1)

式中：

c——多酚的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——提取液體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g；

y——壇紫菜中的多酚含量，mg/g。

1.3.5 多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

(1) 制備紫菜多酚樣品：根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳提取條件，制備大量不同采收期的壇紫菜多酚提取液，低壓真空濃縮除去乙醇溶劑，濃縮液冷凍干燥，得到壇紫菜多酚樣品，-20 ℃貯藏備用。

(2) 多酚對α-葡萄糖苷酶抑制活性測定：將不同采收期的壇紫菜多酚樣品用超純水分別稀釋成不同質(zhì)量濃度(25，50，100，200 mg/mL)的樣品溶液。參考Qi等[11]的方法并略作修改。向96孔板中分別加入20 μL樣品，20 μL 2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液和112 μL的磷酸緩沖溶液(pH 6.8)，孵育后加入20 μL 2.5 mmol/Lp-NPG，再次孵育后加入80 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)。按式(2)計算α-葡萄糖苷酶的抑制率。

(2)

式中：

I——α-葡萄糖苷酶的抑制率，%；

A1——試驗組(α-葡萄糖苷酶+樣品)所測得的吸光值；

A2——試驗對照組(磷酸緩沖溶液+樣品)所測得的吸光值；

A3——空白組(α-葡萄糖苷酶+水)所測得的吸光值；

A4——空白對照組(磷酸緩沖溶液+水)所測得的吸光值。

1.3.6 多酚的抗氧化活性測定

(1) DPPH自由基清除能力：參考屠萬倩等[12]的方法。將凍干所得的不同采收期的壇紫菜多酚樣品用超純水分別稀釋成不同質(zhì)量濃度(0.025，0.050，0.125，0.250，0.500，1.000，2.000，3.000 mg/mL)的樣品溶液。按式(3)計算DPPH自由基的清除率。

(3)

式中：

CDPPH——DPPH自由基清除率，%；

Ax——試驗組(DPPH溶液+樣品)所測得的吸光值；

A1——試驗對照組(無水乙醇+樣品)所測得的吸光值；

A0——空白組(DPPH溶液+水)所測得的吸光值。

(2) ABTS+自由基清除能力：參考Shen等[13]的方法。將凍干所得的不同采收期的壇紫菜多酚樣品用超純水分別稀釋成不同質(zhì)量濃度(0.025，0.050，0.125，0.250，0.500，1.000，2.000，3.000 mg/mL)的樣品溶液。按式(4)計算ABTS+自由基的清除率：

(4)

式中：

CABTS+——ABTS+自由基清除率，%；

Ax——試驗組(ABTS+溶液+樣品)所測得的吸光值；

A0——空白組(ABTS+溶液+水)所測得的吸光值。

(3) 氧自由基吸收能力(ORAC)：參考何麗芳等[14]和陳雪[15]的方法，樣品對氧自由基的吸收能力以Trolox當量表示(μmol Trolox/g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 液料比對壇紫菜多酚提取的影響

由圖1可知，隨著液料比(V乙醇溶液∶m壇紫菜)的增加，多酚含量呈上升趨勢，在液料比為50∶1 (mL/g)時多酚含量達到最大，顯著高于其他液料比(P<0.05)，含量為4.507 mg/g。液料比超過50∶1 (mL/g)后，多酚含量逐漸下降。結(jié)果表明，當液料比為50∶1 (mL/g)時，壇紫菜樣品已完全溶解。過低或過高的液料比都會導致壇紫菜的多酚含量下降[16]。因此，選擇液料比40∶1，50∶1和60∶1 (mL/g)為響應(yīng)面設(shè)計的3個水平。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 乙醇體積分數(shù)對壇紫菜多酚提取的影響

由圖2可知，多酚含量在乙醇體積分數(shù)為60%時達到最大，顯著高于其他乙醇體積分數(shù)的(P<0.05)，含量為3.960 mg/g。當乙醇體積分數(shù)超過60%后，多酚含量顯著下降(P<0.05)，當乙醇體積分數(shù)為90%時，多酚含量僅為0.873 mg/g。造成這種現(xiàn)象的原因是在低濃度乙醇和水環(huán)境中，溶劑很容易進入細胞，而高濃度的乙醇會導致蛋白質(zhì)變性，減少多酚的溶解，從而影響多酚提取含量[17]。因此，選擇乙醇體積分數(shù)50%，60%，70%為響應(yīng)面設(shè)計的3個水平。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3 超聲時間對壇紫菜多酚提取的影響

由圖3可知，超聲時間為50 min時，壇紫菜的多酚含量最大，為4.415 mg/g，顯著高于其他時間提取的(P<0.05)，超聲時間超過50 min后，多酚含量顯著下降(P<0.05)，可能由于提取時間過長，對多酚造成了一定程度的氧化損傷，從而導致多酚含量降低[18]。因此，選擇超聲時間40，50，60 min為響應(yīng)面設(shè)計的3個水平。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果(表1)，以多酚含量為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面設(shè)計(表2)，采用Design-Expert 10軟件對試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，得到多酚含量對液料比、乙醇體積分數(shù)和超聲時間的二次多項回歸模型：

Y=-15.632 0+0.304 6A+0.418 7B+0.040 6C-0.000 7AB+0.000 3AC+0.001 7BC-0.002 8A2-0.004 2B2-0.001 5C2。

(5)

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平

表2 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

通過對圖4～圖6中曲面的坡度和等高線的疏密進行分析可知，試驗中各因素之間的交互作用對壇紫菜多酚含量影響的順序為：BC>AB>AC，與方差分析的結(jié)果一致。

圖4 AB交互作用Figure 4 AB interaction

圖5 AC交互作用Figure 5 AC interaction

圖6 BC交互作用Figure 6 BC interaction

2.5 反應(yīng)條件的優(yōu)化及模型驗證

運用Design-Expert 10軟件分析得到壇紫菜多酚提取的最佳工藝條件為：液料比(V乙醇溶液∶m壇紫菜)51∶1 (mL/g)，乙醇體積分數(shù)56%，超聲時間51 min，在該條件下，提取的壇紫菜多酚含量為5.027 mg/g。考慮儀器設(shè)備及試驗便利，設(shè)定最佳工藝條件為液料比(V乙醇溶液∶m壇紫菜)50∶1 (mL/g)，乙醇體積分數(shù)56%，超聲時間50 min，進行3次平行實驗驗證，結(jié)果測得壇紫菜的多酚含量為(5.203±0.057) mg/g，與預測結(jié)果接近，說明該模型的準確度較高，模型真實有效。

2.6 不同采收期壇紫菜的多酚含量

由圖7可知，隨著采收期的增加，壇紫菜中的多酚含量呈上升趨勢。四水壇紫菜中的多酚含量最高，為6.19 mg/g；其次是頭水壇紫菜與三水壇紫菜，多酚含量分別為5.89 mg/g和5.82 mg/g；二水壇紫菜的多酚含量最低，為5.30 mg/g，顯著低于其他采收期。鐘明杰等[20]報道通過微波輔助提取的壇紫菜多酚含量為4.40～4.77 mg/g，陳洪彬等[7]研究發(fā)現(xiàn)壇紫菜的多酚含量為6.10～6.85 mg/g，與此試驗所測定的多酚含量相比略有差異，可能是由于壇紫菜的生長海域不同導致營養(yǎng)成分有所不同，多酚含量有所差異[20]。綜上，四水壇紫菜多酚含量最高，可選用四水壇紫菜提取多酚，促進四水壇紫菜的高值化利用。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.7 壇紫菜多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由圖8可知，壇紫菜多酚提取物對α-葡萄糖苷酶的活性具有明顯的抑制作用，且呈濃度依賴性，隨著多酚質(zhì)量濃度的增大，其抑制作用不斷增強。當多酚質(zhì)量濃度為100 mg/mL時，壇紫菜多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制活性均達到70%以上。不同采收期的壇紫菜多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用存在一定的差異，四水壇紫菜多酚的抑制活性最高，當多酚質(zhì)量濃度為100 mg/mL時，抑制率為(88.84±0.80)%，顯著高于其他采收期(P<0.05)；其次是三水壇紫菜多酚，抑制率為(86.75±0.34)%；頭水和二水壇紫菜多酚的抑制率差異不顯著(P>0.05)，分別為(75.81±0.35)%和(75.50±0.30)%。

小寫字母不同表示不同采收期差異顯著(P<0.05)

2.8 壇紫菜多酚的抗氧化能力

2.8.1 DPPH自由基的清除能力 由圖9可知，壇紫菜多酚對DPPH自由基具有較強的清除能力，隨著多酚質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除率呈整體上升趨勢。當多酚質(zhì)量濃度為0～1 mg/mL時，4個采收期壇紫菜多酚對DPPH自由基的清除率呈快速上升趨勢；質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，清除率略微下降；質(zhì)量濃度在3 mg/mL時，清除率為42.58%～58.79%；當質(zhì)量濃度>3 mg/mL時，清除率趨于穩(wěn)定。四水壇紫菜多酚對DPPH自由基的清除率顯著高于其他采收期(P<0.05)。

圖9 不同采收期壇紫菜多酚對DPPH自由基的清除能力

2.8.2 ABTS+自由基的清除能力 由圖10可知，隨著多酚質(zhì)量濃度的增加，壇紫菜多酚對ABTS+自由基的清除能力呈上升趨勢，當多酚質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，各采收期壇紫菜多酚的ABTS+自由基清除率達到最大，與董玉婷等[21]的研究結(jié)果基本一致。

圖10 不同采收期壇紫菜多酚對ABTS+自由基的清除能力

2.8.3 氧自由基吸收能力 由圖11可知，隨采收期的增加，ORAC值呈上升趨勢，四水壇紫菜多酚的ORAC值顯著高于其他采收期(P<0.05)，為(35.86±2.12) μmol TE/g，其次是三水壇紫菜多酚，為(29.79±0.76) μmol TE/g，頭水壇紫菜多酚和二水壇紫菜多酚的ORAC值最低且無顯著性差異(P>0.05)，綜上，四水壇紫菜多酚的抗氧化能力強于其他采收期壇紫菜多酚。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化確定了壇紫菜多酚的提取工藝，最優(yōu)的工藝條件為：液料比(V乙醇溶液∶m壇紫菜)51∶1 (mL/g)，乙醇體積分數(shù)56%，超聲時間51 min。在此條件下，提取的多酚含量為5.027 mg/g。在此工藝下提取的不同采收期的壇紫菜多酚，壇紫菜多酚含量不同，其中四水壇紫菜的多酚含量顯著高于其他采收期；壇紫菜多酚對α-葡萄糖苷酶的活性具有較強的抑制作用，其中四水壇紫菜多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用最強，并且其抗氧化能力也最強。因此，四水壇紫菜是開發(fā)天然降血糖食品和抗氧化劑的優(yōu)良食源。后續(xù)將鑒定壇紫菜多酚中具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的物質(zhì)并研究其在人體腸道中的吸收和轉(zhuǎn)化。