潘一廷，張國(guó)城，霍勝偉，田 瑩，劉佳琪，楊振琪，商宇揚(yáng)

(北京市計(jì)量檢測(cè)科學(xué)研究院 國(guó)家生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)治理產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京 100029)

1 引 言

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，生物氣溶膠顆粒物污染防控對(duì)維護(hù)民生健康的重要性日益凸顯。有研究表明新冠病毒存在氣溶膠傳播擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)[1～5]，其可在空氣動(dòng)力學(xué)直徑約1～3 μm的氣溶膠中保持傳染性和完整性達(dá)16 h[6～8]，因此生物氣溶膠引發(fā)的健康風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題已引起廣泛關(guān)注。生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀是一類(lèi)能實(shí)現(xiàn)快速、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物氣溶膠的新興儀器[9～11]。其原理是利用光散射技術(shù)和熒光光譜技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境中發(fā)射特征波長(zhǎng)的生物粒子進(jìn)行監(jiān)測(cè)。近些年，國(guó)內(nèi)外已有大量關(guān)于生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀的相關(guān)研究，尤其是半導(dǎo)體激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)在生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀上的應(yīng)用[12～14]，為實(shí)時(shí)、便捷、快速地監(jiān)測(cè)生物氣溶膠提供了發(fā)展空間。基于熒光法生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀市場(chǎng)需求的爆發(fā)式增長(zhǎng)，生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀性能評(píng)價(jià)研究成為了急需解決的問(wèn)題。

目前，生物氣溶膠監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)方法基本是通過(guò)細(xì)菌產(chǎn)生生物氣溶膠后，再利用微生物采樣方法采集微生物培養(yǎng)[15～17]。由于微生物采樣具有耗時(shí)長(zhǎng)、預(yù)警滯后、菌的存活率以及微生物泄露等問(wèn)題，不太適用于實(shí)時(shí)預(yù)警儀器的評(píng)價(jià)。針對(duì)傳統(tǒng)方法的不足，新的評(píng)價(jià)技術(shù)也在不斷發(fā)展。相對(duì)細(xì)菌微生物，熒光聚苯乙烯微球具有粒徑可控，熒光性質(zhì)穩(wěn)定，保存時(shí)間和溫度受外界條件影響小等特點(diǎn)，適用于生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀計(jì)數(shù)效率的評(píng)價(jià)。而且，針對(duì)生物氣溶膠設(shè)備方面的標(biāo)準(zhǔn)，僅有《顆粒生物氣溶膠采樣和分析通則》[18]對(duì)生物氣溶膠采樣方式進(jìn)行了介紹和規(guī)范，國(guó)內(nèi)現(xiàn)在還沒(méi)有針對(duì)該儀器的校準(zhǔn)規(guī)范和檢定規(guī)程?；诖?，我們開(kāi)展了針對(duì)生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀關(guān)鍵性能參數(shù)計(jì)數(shù)效率的評(píng)價(jià)研究，設(shè)計(jì)并搭建了1套生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀計(jì)數(shù)效率評(píng)價(jià)裝置，通過(guò)制備嚴(yán)格單分散熒光微球，結(jié)合文丘里霧化法發(fā)塵技術(shù)對(duì)生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀熒光通道和總粒子數(shù)2個(gè)通道的計(jì)數(shù)效率評(píng)價(jià)開(kāi)展了相關(guān)研究。

2 生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀組成及原理

圖1 熒光法生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀原理圖Fig.1 Schematic of bioaerosol monitoring instrument based on fluorescence method

熒光法生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀是基于生物本征熒光的激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)(laser induced fluorescence detection，LIF)，利用激光誘導(dǎo)生物性物質(zhì)產(chǎn)生特定的熒光光譜，從而完成對(duì)生物氣溶膠的檢測(cè)和識(shí)別，主要包括激光光源系統(tǒng)、光路處理系統(tǒng)、光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)、氣路系統(tǒng)。其中關(guān)鍵部件光路處理系統(tǒng)包括熒光通道和散射光通道(見(jiàn)圖1)。熒光通道是利用激光誘導(dǎo)生物性物質(zhì)發(fā)出特定波段的熒光，然后通過(guò)光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)將熒光脈沖信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行熒光粒子計(jì)數(shù)。散射光通道是利用激光照射粒子發(fā)生散射，形成1個(gè)光脈沖信號(hào)，然后通過(guò)光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成電脈沖信號(hào)進(jìn)行粒徑測(cè)量和總粒子計(jì)數(shù)。不是所有的分子都會(huì)發(fā)出熒光，而對(duì)于那些能夠發(fā)射熒光的分子，通常需要更高的激發(fā)頻率，當(dāng)某些分子在躍遷的過(guò)程中被激發(fā)時(shí)便會(huì)產(chǎn)生熒光。生物物質(zhì)中含有的氨基酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和核黃素等有機(jī)分子，可在紫外光的激發(fā)下，發(fā)射出本征熒光[19～21]。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 熒光微球的制備

以水/乙醇為介質(zhì)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)為穩(wěn)定劑，偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑，二乙烯基苯(DVB)為交聯(lián)劑，70 ℃反應(yīng)16～24 h，制備得到單分散交聯(lián)聚苯乙烯微球(PS)。制備得到的聚苯乙烯微球通過(guò)SI-ATRP反應(yīng)在PS微球表面修飾上熒光試劑得到熒光微球。具體制備過(guò)程如下：首先稱(chēng)取干燥的PS微球1 g置于三口燒瓶中，加入15 mL二硫化碳溶脹過(guò)夜，加入100 mmol AlCl3和100 mmol二氯丁烷，快速攪拌，50 ℃反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后依次用乙醇、冰醋酸(3%)、水清洗微球，得到含氯修飾的微球。隨后配置反應(yīng)液：0.01 mmol氯化亞銅，0.015 mmol多齒胺，2 mmol甲基丙烯酸縮水甘油酯和700 μL的乙醇渦旋混溶，并通入高純氮?dú)獬シ磻?yīng)體系中的氧，取1 mL反應(yīng)液到上述含氯修飾的聚苯乙烯微球中，一定溫度聚合2～16 h。最后加入羅丹明b酰肼，通過(guò)酰肼和甲基丙烯酸縮水甘油酯上的環(huán)氧基的縮合反應(yīng)制備得到熒光聚苯乙烯微球，聚合后的熒光聚苯乙烯微球用乙醇、水洗3～10次，以除去未反應(yīng)的單體和其他雜質(zhì)。

3.2 生物氣溶膠計(jì)數(shù)效率評(píng)價(jià)

搭建的生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀計(jì)數(shù)效率評(píng)價(jià)裝置組成結(jié)構(gòu)如圖2所示，由霧化發(fā)塵裝置、潔凈氣流、干燥箱和混勻艙組成。使用基于文丘里原理的霧化器，該霧化器是專(zhuān)門(mén)針對(duì)生物氣溶膠計(jì)數(shù)效率評(píng)價(jià)設(shè)計(jì)，只能發(fā)出粒徑小于等于3 μm的粒子，因此極大的減少了大粒徑粒子對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的干擾。將聚苯乙烯微球或熒光微球混懸液從底部導(dǎo)入潔凈氣流霧化，下降過(guò)程中通過(guò)干燥氣體達(dá)到稀釋、干燥的目的，在混勻艙內(nèi)形成濃度穩(wěn)定的氣溶膠?；靹蚺撝杏袃陕凡蓸涌?，分別放置生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀和空氣動(dòng)力學(xué)粒徑譜儀。下方的空氣動(dòng)力學(xué)粒徑譜儀(APS，model 3321，TSI公司，美國(guó))也能夠測(cè)量顆粒物的數(shù)量和濃度，可對(duì)艙內(nèi)的氣溶膠穩(wěn)定性進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。

圖2 生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀計(jì)數(shù)效率評(píng)價(jià)系統(tǒng)示意圖Fig.2 Schematic diagram of counting efficiency of bioaerosol monitor evaluation system

評(píng)價(jià)時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)真空泵的抽氣流量和超高效過(guò)濾器流量，使得生物氣溶膠采樣口和動(dòng)力學(xué)粒徑譜儀采樣口的流量相同，從而提高測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。式(1)為計(jì)數(shù)效率的計(jì)算方法。采樣10 s后，通過(guò)將監(jiān)測(cè)儀計(jì)數(shù)的顆粒物數(shù)量濃度與空氣動(dòng)力學(xué)粒徑譜儀數(shù)量濃度相比(10 s內(nèi)累計(jì)熒光粒子個(gè)數(shù))，通過(guò)計(jì)算可得出熒光粒子計(jì)數(shù)效率：

(1)

(3)投影分帶方法。UTM投影和高斯投影一樣為了減少投影變形進(jìn)行分帶處理。UTM投影將北緯84°至南緯80°之間按經(jīng)度分為60個(gè)帶，每帶6°，從西經(jīng)180°自西向東分帶，兩條標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)線距中央經(jīng)線為180 km左右。高斯投影從0°經(jīng)線開(kāi)始，采用經(jīng)差6°(或3°)自西向東分帶。高斯投影的第1帶是UTM投影的第31帶。

4 結(jié)果和討論

4.1 熒光微球制備與表征

新型熒光聚苯乙烯微球的制備原理和流程如圖3所示，首先將引發(fā)劑二氯丁烷通過(guò)傅克烷基化連接在聚苯乙烯顆粒表面，之后與甲基丙烯酰胺羅丹明(GMA-Rb)單體進(jìn)行ATRP聚合反應(yīng)，在聚苯乙烯顆粒表面原位生長(zhǎng)出熒光聚合物鏈。該方法制備是利用羅丹明B酰肼閉環(huán)無(wú)熒光，開(kāi)環(huán)有熒光的“off-on”結(jié)構(gòu)，制備得到了熒光聚合物-PS雜化熒光微球，它具有嚴(yán)格單分散和穩(wěn)定性好的優(yōu)勢(shì)。熒光單體通過(guò)化學(xué)鍵鏈接，解決了物理吸附制備的熒光微球在霧化過(guò)程中易出現(xiàn)熒光試劑脫落問(wèn)題。從電鏡照片可以看出，制備的PS-Rb微球球形均勻，粒徑單一(參見(jiàn)圖4右部)。而且采用的羅丹明b酰肼物質(zhì)只有在酰肼和環(huán)氧基發(fā)生縮合開(kāi)環(huán)反應(yīng)后才有熒光，吸附上的羅丹明b酰肼試劑無(wú)熒光，這解決了有機(jī)熒光試劑在制備熒光聚苯乙烯微球時(shí)易產(chǎn)生物理吸附的問(wèn)題。如圖5(a)所示，從羅丹明b酰肼和熒光單體GMA-Rb的熒光激發(fā)光譜可以看出，羅丹明b酰肼基本沒(méi)有熒光光譜峰，而GMA-Rb有明顯的激發(fā)峰，在550 nm有最大激發(fā)波長(zhǎng)。從圖5(b)可以看出，在550 nm激發(fā)下，熒光微球PS-Rb在580 nm左右有最大發(fā)射波長(zhǎng)。

圖3 熒光粒子制備過(guò)程示意圖Fig.3 Schematic diagram of the preparation of PS-Rb

圖4 電鏡圖PS微球和PS-Rb微球Fig.4 SEM images of the bare PS and PS-Rb

圖5 熒光光譜及熒光顯微鏡照片F(xiàn)ig.5 Fluorescence spectrum and fluorescence microscope photos

4.2 單分散熒光氣溶膠

霧化發(fā)生器將熒光計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)霧化后可得到粒徑已知、濃度穩(wěn)定的氣溶膠。但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，商品化的熒光計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)霧化以后存在大量的小粒徑非樣本顆粒，已超出生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀計(jì)數(shù)器的測(cè)量范圍。這不僅會(huì)對(duì)儀器造成污染和損害，無(wú)法獲得單分散氣溶膠樣品，還干擾了測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。推測(cè)造成這一現(xiàn)象的主要原因是熒光計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要用于液體計(jì)數(shù)，溶液中含有大量的溶質(zhì)，霧化過(guò)程中會(huì)將懸浮液中的部分溶質(zhì)霧化干燥而形成非樣本顆粒(如表面活性劑顆粒、離子等)。

研究通過(guò)表面原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法制備了用于霧化發(fā)塵的熒光微球，其熒光性質(zhì)穩(wěn)定，粒徑均勻。該類(lèi)熒光微球與溶液中的表面活性劑等溶質(zhì)，在表面修飾過(guò)程中可得到很好的凈化，使得霧化過(guò)程中產(chǎn)生的非樣本顆粒數(shù)量減少，從而較為容易的得到單分散氣溶膠。

4.3 生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀計(jì)數(shù)效率評(píng)價(jià)

評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)儀計(jì)數(shù)效率前，需對(duì)計(jì)數(shù)效率評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試。為保證混勻艙內(nèi)生物氣溶膠的濃度在一定時(shí)間內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，對(duì)混勻艙中氣溶膠的穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)試，將稀釋流量設(shè)置為80 L/min、氣溶膠流量為3 L/min、抽氣流量為10 L/min。進(jìn)行霧化法發(fā)塵5 min后，用動(dòng)力學(xué)粒徑譜儀測(cè)量混勻艙內(nèi)的氣溶膠濃度，為與生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀采集頻率保持一致，每10 s進(jìn)行1次計(jì)數(shù)，每次采集10 s內(nèi)總粒子數(shù)，2 min內(nèi)總粒子數(shù)采集結(jié)果如圖6。

圖6 混勻艙內(nèi)顆粒數(shù)量濃度的穩(wěn)定性Fig.6 The stability of particle number concentration in the chamber

生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀計(jì)數(shù)效率評(píng)價(jià)系統(tǒng)能夠產(chǎn)生穩(wěn)定濃度的單分散氣溶膠粒子，對(duì)系統(tǒng)的穩(wěn)定性測(cè)試表明，在3 min內(nèi)，系統(tǒng)霧化產(chǎn)生的氣溶膠粒子總粒子數(shù)的波動(dòng)小于2%，滿(mǎn)足生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀的校準(zhǔn)和總粒子數(shù)、熒光粒子數(shù)計(jì)數(shù)效率的評(píng)價(jià)需求。

通過(guò)霧化法將粒徑3 μm的PS微球和PS-Rb熒光微球形成單分散氣溶膠，待混勻艙內(nèi)氣溶膠數(shù)量濃度穩(wěn)定后，開(kāi)啟生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀和TSI空氣動(dòng)力學(xué)粒徑譜儀進(jìn)行采樣分析，計(jì)數(shù)結(jié)果如表1和表2所示。從表1和表2中可以得出，經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)以后，霧化3 μm PS微球形成氣溶膠，總粒子通道平均計(jì)數(shù)效率可達(dá)100.7%，熒光粒子通道無(wú)計(jì)數(shù)。而3 μm PS-Rb微球霧化形成的氣溶膠，總粒子數(shù)和熒光粒子通道平均計(jì)數(shù)效率可達(dá)到98.9%和98.1%。這說(shuō)明制備的熒光微球能夠形成單分散氣溶膠，可以同時(shí)滿(mǎn)足熒光法生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀≥0.5 μm的總粒子和熒光粒子2個(gè)通道的計(jì)數(shù)效率評(píng)價(jià)需求。

表1 3 μm PS計(jì)數(shù)結(jié)果Tab.1 Results as measured by 3 μm PS

表2 3 μm PS-Rb熒光微球計(jì)數(shù)結(jié)果Tab.2 Results as measured by 3 μm PS-Rb

5 結(jié) 論

針對(duì)生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀總粒子和熒光粒子2個(gè)通道的計(jì)數(shù)效率評(píng)價(jià)，利用SI-ATRP法制備了單分散、熒光性質(zhì)穩(wěn)定的熒光聚苯乙烯微球。同時(shí)采用基于霧化發(fā)塵法搭建了1套生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀計(jì)數(shù)效率評(píng)價(jià)系統(tǒng)，并應(yīng)用于生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀計(jì)數(shù)效率的評(píng)價(jià)，2個(gè)通道的平均計(jì)數(shù)效率分別達(dá)到98.9%和98.1%。實(shí)現(xiàn)了生物氣溶膠監(jiān)測(cè)儀總粒子數(shù)和熒光粒子數(shù)計(jì)數(shù)效率的校準(zhǔn)與評(píng)價(jià)。該研究結(jié)果為進(jìn)一步深入開(kāi)展相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。