李務(wù)榮, 楊 彬, 黃彥捷, 張 寧, 羅思婷,王 晶, 鄔泉周, 武利慶

(1. 廣東省計(jì)量科學(xué)研究院 廣東省現(xiàn)代幾何與力學(xué)計(jì)量技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510405；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院, 廣東 廣州 510006；3. 中國計(jì)量科學(xué)研究院 前沿計(jì)量科學(xué)中心(生命科學(xué)計(jì)量研究所)， 北京 100029)

1 引 言

血清中的葡萄糖(以下簡稱：血糖)對糖尿病的診斷、治療、監(jiān)測具有重要意義,因此其含量測定是臨床實(shí)驗(yàn)室頻率最高的實(shí)驗(yàn)之一[1]。血糖作為糖尿病診斷與治療的重要指標(biāo),其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確與否直接影響糖尿病診斷治療的正確性；因此,保證血糖檢測量值的準(zhǔn)確可比具有十分重要的意義。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為量值的載體,在實(shí)現(xiàn)量值溯源傳遞、保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確可比等方面具有十分重要的意義[2～5]。

目前,常用的血清葡萄糖含量檢測方法主要有氧化酶-偶聯(lián)比色法、微電流法、氧速率法、己糖激酶法、鄰甲苯胺法、葡萄糖脫氫酶法、微創(chuàng)測定法、同位素稀釋液相色譜-質(zhì)譜法、同位素稀釋氣相色譜-質(zhì)譜法等[6～11]。其中,同位素稀釋質(zhì)譜法(IDMS)是唯一一種微量、痕量和超痕量物質(zhì)量值檢驗(yàn)的權(quán)威方法[12，13]。近年來,IDMS是最常用的臨床檢驗(yàn)量值的基準(zhǔn)方法。通過向樣品溶液中加入一種同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)物,待溶質(zhì)與標(biāo)記物溶液充分平衡后,對樣品進(jìn)行預(yù)處理,利用同位素稀釋-氣相色譜-質(zhì)譜法(ID-GC-MS)或同位素稀釋-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(ID-LC-MS/MS)測定標(biāo)記物與溶質(zhì)的峰強(qiáng)度比來測定溶質(zhì)的濃度，該法具有特異性高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。用IDMS法對血清葡萄糖濃度測定,具有特異性高、靈敏度好,不易受血清中還原性物質(zhì)的干擾等特點(diǎn)。丁兆婷等應(yīng)用同位素稀釋氣相色譜-質(zhì)譜法對2種不同濃度血清葡萄糖進(jìn)行定值,測量結(jié)果的總相對標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為1.65%及2.24%[14]；張?zhí)鞁傻冉⒘?種使用同位素稀釋液相色譜-質(zhì)譜法測定血清葡萄糖的方法,國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 965a的測定結(jié)果與認(rèn)定值的平均偏差為-0.2%[15]。但是目前仍缺乏不同IDMS測定葡萄糖方法間的結(jié)果比照,以及對相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值研究的報(bào)道。

本研究針對血清葡萄糖檢測量值溯源傳遞的需求和便攜式血糖分析儀檢測校準(zhǔn)的需要,研制了系列血清中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。并采用ID-LC-MS/MS及ID-GC-MS兩種方法對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值。該系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有望用于臨床檢驗(yàn)及相關(guān)領(lǐng)域?qū)ρ迤咸烟琼?xiàng)目測量的質(zhì)量評價(jià)、檢測系統(tǒng)性能評價(jià)、實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證及相關(guān)試劑的量值傳遞等方面。

2 主要儀器與試劑

2.1 主要儀器

2500葡萄糖乳酸鹽分析儀(美國YSI公司)；7180型全自動生化分析儀(日本HITACHI公司)；AU5800生化分析儀(美國BECKMAN COULTER公司)；氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)(GC-MS),GC部分為7890A(美國Agilent公司),MS部分為5975C(美國Agilent公司)；高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)(LC-MS/MS),包括高效液相色譜儀Agilent 1290 Infinity II(美國Agilent公司)、串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀6470(美國Agilent公司)和QQQ Quantitative Analysis數(shù)據(jù)處理軟件；渦旋振蕩器以及離心機(jī)(美國Sigma公司)。

2.2 主要試劑

GBW10062葡萄糖純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),99.6%(中國計(jì)量科學(xué)研究院)；[13C6]葡萄糖,同位素豐度99%(美國Cambridge Isotope Laboratories)；1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮(PMP,純度99%)(美國Sigma)；鹽酸羥胺,分析純,99.5%(天津大茂化學(xué)試劑廠)；吡啶,分析純,99.5%(美國Sigma)；疊氮化鈉,分析純,99%(美國Sigma)；冰醋酸,分析純,98%,(美國Fisher)；氨水,25%,(美國Sigma)；乙酸酐,分析純,99%(美國Fisher)；無水乙醇、乙腈、氯仿、二氯甲烷、丙酮,HPLC級(美國Fisher)。

3 實(shí)驗(yàn)部分

3.1 人血清中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

3.1.1 原料選取

本次血清原料是委托了生物技術(shù)服務(wù)公司從醫(yī)院收集志愿者血清得到,分別使用羅氏cobas e 411免疫分析儀及希森美康HISCL-5000免疫分析儀,經(jīng)化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測,HBsAg、HCV抗體、HIV抗體的檢測結(jié)果為陰性,但仍不排除其潛在生物傳染性,因此后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制過程均按照二級生物安全標(biāo)準(zhǔn)防護(hù),處理按照生物傳染性樣品進(jìn)行。

3.1.2 濃度范圍設(shè)計(jì)

根據(jù)GB/T 19634-2005《體外診斷檢驗(yàn)系統(tǒng)自測用血糖監(jiān)測系統(tǒng)通用技術(shù)條件》[16]及衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕209號《醫(yī)療機(jī)構(gòu)便攜式血糖檢測儀管理和臨床操作規(guī)范》中規(guī)定的重復(fù)性試驗(yàn)用血糖濃度范圍,設(shè)計(jì)6種系列人血清中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的目標(biāo)濃度覆蓋1.5～28.0 mmol/L。

3.1.3 葡萄糖添加

采用基于酶膜法的YSI 2500葡萄糖乳酸鹽分析儀對血清樣本初步測定其血糖含量。

其中水平2為采集的正常人血清血糖濃度。

高濃度血糖樣品(水平3～6)的獲取：使用葡萄糖純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制高濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別計(jì)算添加量,使用微量移液器直接加入血清中充分混勻獲得。

低濃度血糖樣品(水平1)的獲取：將正常人血清在培養(yǎng)箱中37 ℃孵育約6 h,通過微生物糖降解的方式下降至所需的水平獲得。

3.1.4 分裝與保存

將上述侯選物經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后各分裝至1.5 mL凍存管中,每管約1.0 mL,共計(jì)約300單元,置于-70 ℃冰箱中保存。

3.2 均勻性檢驗(yàn)

采用HITACHI 7180型全自動生化分析儀對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性進(jìn)行檢驗(yàn)。根據(jù)JJF 1343-2022的要求[17],每個水平的侯選物分別取出11個單元,每個單元的侯選物重復(fù)測定3次,對其進(jìn)行方差分析,分析結(jié)果列于表1。

表1 系列人血清中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性數(shù)據(jù)單因素方差分析結(jié)果Tab.1 Results of one-way ANOVA on glucose reference material uniformity data in serial human serum

表1中所有水平候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的F

3.3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性同樣是衡量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性的1個重要參數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的短期穩(wěn)定性與樣品運(yùn)輸過程中的外部因素有關(guān),長期穩(wěn)定性與貯存條件有關(guān)。

3.3.1 長期穩(wěn)定性考察

對人血清中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性進(jìn)行長期穩(wěn)定性考察,為期12個月。將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲存于-70 ℃條件下,不同時(shí)間間隔每次取出3個樣品進(jìn)行穩(wěn)定性考察,測試結(jié)果見圖1。對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析,計(jì)算回歸參數(shù),并對斜率β進(jìn)行t-檢驗(yàn),結(jié)果列于表2中。

由表2可知,6個水平的均符合|β|

圖1 不同濃度水平人血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性結(jié)果Fig.1 Results of glucose reference material stability in human serum at different concentration levels

表2 系列人血清中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性統(tǒng)計(jì)分析Tab.2 Statistical analysis of glucose reference material stability in serial human serum

3.3.2 短期穩(wěn)定性考察

短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)溫度分別為-20、4、25和60 ℃，在各個溫度下的考察時(shí)間均為7 d,不同間隔時(shí)間每次取出3個樣品進(jìn)行穩(wěn)定性考察。首次放置樣品取出1個樣品保存在-70 ℃作為參考。采用與長期穩(wěn)定性分析相同的方法,對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析,計(jì)算回歸參數(shù),并對斜率β進(jìn)行t-檢驗(yàn)。結(jié)果表明6個水平人血清中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20 ℃可以穩(wěn)定保存7 d；在4 ℃溫度條件下水平2～水平6標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可穩(wěn)定7 d,水平1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以穩(wěn)定3 d；在25 ℃溫度條件下發(fā)現(xiàn)6個水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可穩(wěn)定1 d；60 ℃溫度條件下6個水平樣本統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均不穩(wěn)定。因此確定該系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)當(dāng)在-20 ℃溫度條件下進(jìn)行運(yùn)輸為宜。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

3.4.1 人血清密度測定

在20 ℃時(shí),水的密度為0.998 62 g/cm3,以此為參比,分別對蒸餾水及人血清進(jìn)行稱量,根據(jù)稱量蒸餾水和人血清的質(zhì)量和實(shí)際體積,計(jì)算得到人血清的密度約為1.023 15 g/cm3。

3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別配制約1.5 mmol/L葡萄糖溶液及[13C6]葡萄糖內(nèi)標(biāo)溶液,混合得到標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3.4.3 同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

(1)同位素稀釋

樣品中加入同位素內(nèi)標(biāo)后,加入適量無水乙醇,以1 500g的速度離心5 min。加入PMP-氨水衍生,70 ℃反應(yīng)90 min后靜置冷卻至室溫,加入乙酸中和反應(yīng)系統(tǒng)；再加入等體積去離子水和氯仿,萃取后取水相上機(jī)分析。

(2)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析

液相色譜條件：色譜柱為ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱,流動相為水(含乙酸,pH=3.5)-乙腈(75:25,體積比),流速為0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件：使用電噴霧電離源(ESI)正離子模式和多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式,檢測的離子對為m/z=511.4→175.1和m/z=517.4→175.1。

(3)定值計(jì)算

定值計(jì)算模型為

(1)

式中：C為血清中葡萄糖的濃度, mmol/L；Isam為樣品中葡萄糖與內(nèi)標(biāo)的峰面積比(測定值)；Ilow為低標(biāo)中葡萄糖與內(nèi)標(biāo)的峰面積比(測定值)；Ihigh為高標(biāo)中葡萄糖與內(nèi)標(biāo)的峰面積比(測定值)；Wlow為低標(biāo)中葡萄糖與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量比；Whigh為高標(biāo)中葡萄糖與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量比；Mis為血清樣品中內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量,mg；Mser為血清樣品的質(zhì)量,g；Ds為血清的密度；180.16為葡萄糖的相對分子質(zhì)量。

通過測定葡萄糖與標(biāo)記葡萄糖的峰面積比,可計(jì)算血清樣品中葡萄糖的準(zhǔn)確含量。每個水平血清中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各取5個單元,每個單元重復(fù)測定3次,結(jié)果見表3。

表3 ID-LC-MS/MS方法定值結(jié)果

3.4.4 同位素稀釋氣相色譜-質(zhì)譜法

(1)同位素稀釋

樣品中加入同位素內(nèi)標(biāo)后,加入適量無水乙醇,以3 000g的速度離心5 min。取上清液于60 ℃下氮?dú)獯蹈?。加入鹽酸羥胺的吡啶溶液,90 ℃反應(yīng)25 min;再加入乙酸酐,90 ℃反應(yīng)25 min 后氮?dú)獯蹈?。加入二氯甲烷?fù)溶,過濾后上機(jī)分析。

(2)氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析

氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度270 ℃分流進(jìn)樣,分流比為1:40；升溫程序?yàn)閺?25 ℃以20 ℃/min升至180 ℃,保持5 min后以3 ℃/min升至205 ℃,保持1 min后以6 ℃/min升至250 ℃,恒溫5 min。載氣為He氣。

質(zhì)譜條件：離子源溫度200 ℃；傳輸線溫度270 ℃；電離方式為70 eV EI；發(fā)射電流為0.2 mA；采集方式為SIM選擇離子監(jiān)測,雙通道m(xù)/z=314和319。

(6)定值計(jì)算

計(jì)算模型與ID-LC-MS/MS法一致。每個水平血清中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各取5個單元,每個單元重復(fù)測定3次,結(jié)果見表4。

表4 ID-GC-MS方法定值結(jié)果Tab.4 Result of ID-GC-MS method

3.4.3 兩種定值方法分析

在ID-LC-MS/MS方法中,檢測使用的母離子質(zhì)荷比為511及517,其分子量差為6,與天然葡萄糖及標(biāo)記葡萄糖的分子量差相同。然而ID-GC-MS方法中,檢測使用的母離子質(zhì)荷比為314及319,2者差為5。對這一現(xiàn)象進(jìn)行了具體探討,ID-LC-MS/MS衍生化產(chǎn)物分子式為C26H30N4O7,其相對分子質(zhì)量為510.41。若使用同位素標(biāo)記的葡萄糖進(jìn)行衍生化,得到的產(chǎn)物分子式為13C612C20H30N4O7,其相對分子質(zhì)量為516.41[8]。ID-GC-MS衍生化過程涉及的反應(yīng)如圖2所示。

得到的衍生化產(chǎn)物分子式為：C16H21NO10,其相對分子質(zhì)量為387.34。若使用同位素標(biāo)記的葡萄糖進(jìn)行衍生化,最終得到的衍生化產(chǎn)物分子式為13C612C10H21NO10,其相對分子質(zhì)量為393.34。衍生化產(chǎn)物在質(zhì)譜中主要發(fā)生碎片的斷裂過程(脫去了原本屬于葡萄糖分子中的1個C)如圖3所示。

圖2 ID-GC-MS方法葡萄糖衍生化過程Fig.2 Glucose-derived process in ID-GC-MS method

圖3 ID-GC-MS方法葡萄糖衍生物裂解過程Fig.3 The Glucose-derivative cleavage process in ID-GC-MS method

對于天然葡萄糖衍生化產(chǎn)物,主要碎片離子峰的分子式為C13H14NO8,其相對分子質(zhì)量為313.26；對于同位素標(biāo)記的葡萄糖衍生化產(chǎn)物,主要碎片離子峰的分子式為13C512C8H14NO8,其相對分子質(zhì)量為318.26。使用電子轟擊源(EI)正離子模式和單離子檢測掃描(SIM)模式分析,檢測的離子為m/z=314,387(天然葡萄糖)和m/z=319,393([13C6]葡萄糖)時(shí),m/z=387及393的保留時(shí)間較短,且峰面積僅為m/z=314及319的1%,說明衍生化產(chǎn)物在該質(zhì)譜條件下不能穩(wěn)定存在,檢測m/z=314及319的碎片離子峰更為穩(wěn)定。

由此可見,雖然2種同位素稀釋質(zhì)譜方法中分子量差不同,但2種方法均是準(zhǔn)確可靠的,且經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)及獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn),證明方法間方差齊性且等精度,在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著性差異。根據(jù)JJF 1006-1994《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》,將全部數(shù)據(jù)視為1組新的測量數(shù)據(jù),計(jì)算全部原始數(shù)據(jù)的總平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果詳見表5。

3.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度評估

系列人血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物定值結(jié)果的不確定度來源于定值過程中引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性引入的不確定度、短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性引入的不確定度。定值過程中引入的不確定度分量包含溶液的配制(標(biāo)準(zhǔn)溶液及同位素標(biāo)記溶液)、血清樣本的稀釋、密度測定及純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等分量。各不確定分量的評定結(jié)果見表6。表6中u11，u12，u13合成得u1；u1，u2，u3，u4合成得uc。

表5 系列血清中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果Tab.5 Results of glucose reference material in human serum mmol/L

3.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)評估

基質(zhì)效應(yīng)是各種臨床檢驗(yàn)質(zhì)量保證中的常見問題。在量值溯源中,其存在限制了某些參考物質(zhì)、校準(zhǔn)物和質(zhì)控物的直接使用,影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于臨床檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在使用中可能受基質(zhì)效應(yīng)的影響,對評價(jià)指標(biāo)(特別是靶值)的設(shè)定將帶來諸多問題。因此在應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)之前,需要考察它們對常規(guī)測量過程是否存在基質(zhì)效應(yīng),這是量值溯源的重要前提。

臨床中,葡萄糖的測定方法主要有己糖激酶(HK)法和葡萄糖氧化酶(GOD)法。因此分別選用2種常規(guī)分析系統(tǒng),HK法采用BECKMAN COULTER AU5800生化分析儀,GOD法采用YSI 2500葡萄糖乳酸鹽分析儀,分別測試31份新鮮臨床病人血清樣本,對該系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評估，結(jié)果如圖4、圖5所示。評估方法的測定均值均在y值的95%置信區(qū)間內(nèi),說明研制的系列人血清中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對不同常規(guī)分析方法均無基質(zhì)效應(yīng)。

4 結(jié) 論

應(yīng)用ID-LC-MS/MS法和ID-GC-MS法2種方法研制了6種不同濃度血清葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值,定值結(jié)果分別為：(1.70±0.04) mmol/L；(6.61±0.15) mmol/L；(9.78±0.23) mmol/L；(14.02±0.32) mmol/L；(19.06±0.41) mmol/L；(28.12±0.58) mmol/L。該系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有良好的均勻性,且在-70 ℃的保存條件下穩(wěn)定12個月,在多種常規(guī)分析系統(tǒng)上無明顯的基質(zhì)效應(yīng)。該系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)填補(bǔ)了臨床葡萄糖檢測溯源參考系統(tǒng)的空白,彌補(bǔ)了GB/T 19634-2005《體外診斷檢驗(yàn)系統(tǒng)自測用血糖監(jiān)測系統(tǒng)通用技術(shù)條件》等國家標(biāo)準(zhǔn)在執(zhí)行過程中高、低極值點(diǎn)的準(zhǔn)確度評價(jià)沒有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)支撐的短板。該系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于檢測校準(zhǔn)、質(zhì)量控制等方面,有望在糖尿病的臨床診斷中發(fā)揮重要作用。

表6 系列血清中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度評定結(jié)果Tab.6 Results of glucose reference material uncertainty evolution in human serum

圖4 BECKMAN COULTER AU5800生化分析儀測定結(jié)果Fig.4 Results of BECKMAN COULTER AU5800 biochemical analyzer

圖5 YSI 2500葡萄糖乳酸鹽分析儀測定結(jié)果Fig.5 Results of the YSI 2500 glucose lactate analyzer