楊浩東 謝興文 李寧 李鼎鵬 丁聚賢 姚乾寧劉凱

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州730000 2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州730000 3. 甘肅省第二人民醫(yī)院/西北民族大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種全身性骨代謝疾病，主要由于骨代謝過程中各種致病因素造成成骨細胞(osteoblast,OB)與破骨細胞(osteoclast,OC)介導(dǎo)的骨形成和骨吸收失衡，導(dǎo)致骨吸收大于骨形成。主要表現(xiàn)為單位體積內(nèi)的骨量減少、骨密度(bone mineral density,BMD)下降以及骨微結(jié)構(gòu)的改變，以致骨的脆性增加，增加患者的骨折風(fēng)險[1-2]。據(jù)研究調(diào)查[3]，在我國50歲以上的人群中，男性的患病率約為6.46%，而女性由于絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素分泌減少，患病率達到了29.13%，尤其在60歲以上人群中，OP患病率明顯增高。由OP并發(fā)的骨質(zhì)疏松性骨折已成為造成中老年人群殘疾和死亡的主要原因之一[4]，給患者及家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)和嚴重的社會負擔(dān)[5]。

目前，在臨床上治療OP主要以西醫(yī)治療為主，患者通過服用甲狀旁腺素、維生素D等促進骨形成的藥物以及降鈣素、雙膦酸鹽等抑制骨吸收的藥物來改善骨質(zhì)情況，但是這些藥物都有明顯的不良反應(yīng)和副作用[6]，并且臨床治療效果也難以令人滿意。近年來，中醫(yī)藥以其多生物活性成分、多靶點、多通路協(xié)同、高效價廉和副作用少的治療優(yōu)勢在OP的防治中發(fā)揮了重要的作用，并且取得了良好的臨床療效。神經(jīng)源性位點缺口同源蛋白(Notch)信號通路作為細胞內(nèi)一條重要的信號傳導(dǎo)通路，能夠參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。相關(guān)研究證實[7]，Notch信號通路作為重要的骨重建通路在調(diào)控與維持骨代謝穩(wěn)定方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，可以通過影響OB和OC的分化和平衡，從而促進骨的形成，抑制骨的吸收，是當(dāng)今研究和治療OP的新靶點。因此，可以通過調(diào)控Notch信號通路相關(guān)蛋白的表達，影響相關(guān)骨細胞的代謝，從而糾正機體的骨失衡狀態(tài)，恢復(fù)成骨量與破骨量之間的動態(tài)平衡。本文將對中藥單體及復(fù)方調(diào)控Notch信號通路防治OP的相關(guān)研究進行綜述，闡明運用中藥單體及復(fù)方干預(yù)影響Notch信號通路相關(guān)靶蛋白的表達治療OP的作用機制，以期為運用中醫(yī)藥更好的防治OP提供有益參考。

1 Notch信號通路

1.1 Notch信號通路的組成

摩爾根在做果蠅突變實驗時發(fā)現(xiàn)了Notch信號通路，因其代表的功能缺失使得果蠅翅膀形成缺刻而命名[8]。Notch信號通路在高、低等動物體內(nèi)均有表達，具有高度保守的特性，主要由受體、配體、DNA結(jié)合蛋白、DNA結(jié)合蛋白胞內(nèi)效應(yīng)分子、效應(yīng)物以及調(diào)節(jié)分子組成。在哺乳動物體內(nèi)，Notch通路主要由4種受體蛋白(Notch-1、2、3、4)和5種配體蛋白(Delta-1、3、4，Jagged-1、2)以及Notch調(diào)節(jié)因子及下游發(fā)狀分裂相關(guān)增強子(hairy and enhancer of split,Hes)、Hey蛋白組成[9]，在細胞的增殖和分化以及凋亡等過程中有著十分重要的調(diào)控作用[10]，在許多生物體內(nèi)的組織和器官中都發(fā)揮著重要的作用。

1.2 Notch信號通路的激活過程

Notch通路以細胞間接觸的方式進行信號傳遞，因此又被稱之為復(fù)合信號結(jié)合蛋白-J(recombination signal binding protein-J,RBP-J)依賴通路，其通過細胞表面的配體蛋白與相鄰細胞表面的受體相結(jié)合的方式進行信號傳遞過程。Notch通路的活化需要經(jīng)過三個階段[11]：①受體蛋白是由多肽段構(gòu)成的異二聚體，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成之后，轉(zhuǎn)移至高爾基體，在弗林蛋白轉(zhuǎn)化酶的作用下，行第1次酶切，被切割為N端胞外配體結(jié)合區(qū)和C端跨膜亞單位；②在配體與受體結(jié)合后，在去整合素金屬蛋白酶作用下，行第2次酶切，使受體釋放細胞外亞單位；③切割產(chǎn)生的Notch片段被γ-分泌酶第3次酶切，釋放Notch細胞內(nèi)區(qū)(notch intracellular domain,NICD)入核，在細胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子RBP-J、智者基因樣特異性結(jié)合形成核轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族復(fù)合體，對下游Hes、Hey蛋白進行調(diào)控，轉(zhuǎn)錄下游基因發(fā)揮生物學(xué)功能[12]。

2 Notch信號通路與OP

2.1 Notch信號通路對OB的影響

OB是骨形成的主要功能細胞，能夠影響骨的形成和重建過程，來源于骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)。OB由BMSCs分化而來，此過程經(jīng)歷了由不同轉(zhuǎn)錄因子及信號蛋白調(diào)控的多個階段。研究發(fā)現(xiàn)[13]，Notch信號通路能夠影響OB的增殖、分化和骨化等過程，能夠激活BMSCs前體向OB分化。Notch通路在調(diào)節(jié)過程中具有雙向調(diào)節(jié)的作用，在早期成骨分化中發(fā)揮促進成骨的作用，而后期則抑制OB的增殖和分化。激活BMSCs中的Notch信號通路，不僅可以促進BMSCs的增殖，而且能夠維持其干細胞特性，抑制BMSCs的分化，而在BMSCs中抑制Notch信號通路的激活，則可以促進干細胞的分化，使其進入成骨或成軟骨的狀態(tài)[14]。研究發(fā)現(xiàn)[15]，Notch信號通路的配體蛋白Jagged-1是BMD的決定因子，Jagged-1蛋白的大量表達能夠促進骨折的早期愈合，并且抑制BMSCs高密度長期培養(yǎng)所導(dǎo)致的細胞老化，增強其成骨分化。Notch信號通路能夠正向調(diào)節(jié)骨形成蛋白信號抑制劑頭蛋白(Noggin)的釋放，從而促進骨小梁形成，增加成骨前體細胞的數(shù)量[16]。

2.2 Notch信號通路對OC的影響

OC是骨吸收的主要功能細胞，在骨的發(fā)育、成長、修復(fù)和重建過程中發(fā)揮著重要作用，來源于骨髓造血干細胞。有報道[17]指出Notch信號通路與OC的增殖和凋亡過程密切聯(lián)系，通過下調(diào)Notch信號通路的活性可以達到抑制OC凋亡，增加OC增殖能力的作用，Notch通路中的Nocth-1蛋白高表達可以促進δ樣配體3、Jagged-1的表達，使OC形成數(shù)量明顯減少[18]，而Nocth-2的表達量與OC的增殖能力呈正相關(guān)。相關(guān)研究[19]發(fā)現(xiàn)，微小RNA對OC的活性有著重要的影響，miR-187可以通過增強Nocth-1通路的活性，抑制Nocth-2通路達到抑制OC的增殖與分化，并且誘導(dǎo)OC凋亡，減少OC的存活。

3 中藥調(diào)控Notch信號通路與OP

3.1 中藥單體

隨著對中藥單體研究的深入，大量實驗結(jié)果表明，中藥單體在防治OP方面有著顯著的治療效果。骨碎補作為骨科常用藥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明[20]，其主要有效成分總黃酮(davallia mariesil flavones,DMF)能夠維持OP患者的骨微結(jié)構(gòu)的完整程度，并提升BMD。研究證實[21]，DMF能夠顯著降低骨髓基質(zhì)細胞中Notch-1 mRNA、Hes-1 mRNA以及Notch-1、Hes-1等蛋白的表達水平，其促進骨形成，抑制骨吸收，增加BMD的作用機制與Notch信號通路相關(guān)。前期研究證實[10]，齊墩果酸(oleanolic acid,OA)能抑制Notch信號通路的激活，且呈現(xiàn)劑量依賴性，能夠促進BMSCs早期的OB分化，從而促進骨形成。程韶等[22]通過微型滲透泵對去勢大鼠骨折部位進行局部緩釋OA干預(yù)，實驗發(fā)現(xiàn)，OA能夠促進骨折的愈合，且干預(yù)14 d的作用顯著大于28 d，證實了OA能夠促進早期骨形成，通過降低骨痂組織中Hes1 mRNA的表達，抑制Notch通路靶基因Hes1的表達從而促進BMSCs的成骨分化。白藜蘆醇(resveratrol,RES)是中藥虎杖的活性單體，研究發(fā)現(xiàn)[23]RES能夠通過調(diào)控Notch通路，上調(diào)Notch-1的表達，上調(diào)cyclin-D1的m RNA轉(zhuǎn)錄水平，而下調(diào)負調(diào)控細胞的分裂及增殖的p53的m RNA轉(zhuǎn)錄水平，促進大鼠骨組織中的OB增殖。淫羊藿作為傳統(tǒng)中藥，最早見于《神農(nóng)百草經(jīng)》，具有補腎壯陽，祛風(fēng)除濕的功效[24]。淫羊藿苷作為淫羊藿的主要有效成分之一，研究[25]發(fā)現(xiàn)其具有維持骨代謝平衡、誘導(dǎo)骨形成、增加BMD的作用。淫羊藿苷能夠促進Notch通路中Notch-1、Jagged-1 、C-啟動子結(jié)合因子-1等蛋白的表達，上調(diào)Hesl mRNA和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 mRNA表達，促進BMSCs向OB分化，從而發(fā)揮防治OP的作用[26]。

另有研究指出[27-29]，刺五加苷、補骨脂素和連翹酯苷A等中藥有效成分均能通過介導(dǎo)Notch信號通路干預(yù)BMSCs的成骨分化，并且影響相關(guān)骨細胞的凋亡防治OP。

3.2 中藥復(fù)方

中醫(yī)認為，OP發(fā)生的根本病因是由于患者肝腎虧虛所引起，如《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》中所云“腎氣熱，……骨枯而髓減，發(fā)為骨痿?！痹谥委煼矫?，《素問》曰 “腎者，……封藏之本，……其充在骨，……通于冬氣?！泵鞔_了腎具有壯骨生髓的作用。因此，從古到今各代醫(yī)家治療OP的遣方用藥都以補肝腎為要，并且在臨床的應(yīng)用中取得了良好的治療效果。

劉蔚楠等[30]探討了益腎健骨膏對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝的影響，研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腰椎中的Notch 1、2及其配體Jagged 1、2的mRNA及蛋白表達均顯著降低，而在經(jīng)過益腎健骨膏的治療后，高劑量膏方組中大鼠的BMD、骨強度及骨形成指標(biāo)都顯著提升，而骨吸收的指標(biāo)水平顯著降低，并且除模型組之外，其余各組中上述基因的mRNA及蛋白表達均顯著提高，證明益腎健骨膏可能通過影響Notch通路蛋白的表達促進骨形成，抑制骨吸收，從而減少去勢大鼠骨量的丟失。吳結(jié)枝等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，壯骨止痛膠囊能夠通過調(diào)控BMSCs的Notch信號通路，提高Hes、Notch-1、Jagged-1等蛋白的表達水平，調(diào)節(jié)BMSCs向OB分化，改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型大鼠骨基質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，提高BMD。許日明等[32]研究了溫腎固疏方對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎陽虛型患者的影響，發(fā)現(xiàn)溫腎固疏方組患者在治療后BMSCs中的Notch-1、Jagged-1、Hes-1的mRNA等蛋白的表達水平均高于其他組，提示溫腎固疏方可能通過調(diào)節(jié)Notch通路提高類固醇受體活化輔激活因子3、過氧化物酶體增殖活化受體-1a、B淋巴細胞瘤-2水平，恢復(fù)BMSCs功能，促進OB生長，提高患者BMD。實驗證明[33]，固本增骨方能夠促進BMSCs進行增殖，并促進其進行成骨分化、而抑制其成脂分化，通過上調(diào)Notch-1 mRNA的表達水平以及下調(diào)C啟動子結(jié)合因子1 mRNA水平，從而促使BMSCs成骨分化過程中Ⅰ型膠原蛋白、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2、骨鈣蛋白等成骨基因蛋白的表達，促進OB的增殖。

另有研究證明[34-39]，補腎方藥如左歸丸、右歸丸、補腎復(fù)方和益骨膠囊等均可以通過調(diào)控Notch通路活性，影響與成骨和破骨相關(guān)細胞的增殖和凋亡，有效發(fā)揮骨質(zhì)疏松癥的防治作用。

4 小結(jié)

綜上所述，現(xiàn)有的研究結(jié)果證明中藥單體及中藥復(fù)方治療OP的效果顯著，且具有多方向調(diào)節(jié)、多靶點干預(yù)的治療特點，可以通過調(diào)控Notch信號通路相關(guān)蛋白的活性，調(diào)節(jié)靶基因蛋白的表達，影響B(tài)MSCs、OB、OC等細胞的增殖分化和凋亡，維持骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡，達到防治OP的效果。

但目前基于此通路防治OP的中醫(yī)藥療法基本以中藥單體及中藥復(fù)方為主，未涉及針灸、穴位貼敷、臟腑推拿等具有中醫(yī)特色療法在此方面的研究，且大部分現(xiàn)有的研究也僅停留在動物實驗研究的基礎(chǔ)階段，這也是今后應(yīng)努力研究的方向和目標(biāo)。下一步應(yīng)致力于探究臨床研究的治療效果，同時以Notch信號通路為支點，挖掘出更多的中藥有效成分和中藥復(fù)方，擴大中醫(yī)藥特色療法防治OP的應(yīng)用范圍，探究與其他通路的協(xié)同治療作用。