胥鵬 唐丁炫 張疆弢

遵義醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院正畸科一組，貴州 遵義 563000

在人體內，晝夜節(jié)律參與并調控體內各項生理活動并呈現出以24 h為周期的波動，其產生的基礎是生物鐘基因的節(jié)律性表達。晝夜節(jié)律由中央生物鐘和外周生物鐘組成[1]。外周生物鐘由分子振蕩器維持，包括轉錄因子腦和肌肉ARNT樣蛋白1(brain and muscle arntlike 1，BMAL1)、生物鐘循環(huán)輸出蛋白(circadian locomotor output cycles kaput，CLOCK )、周期蛋白(period，PERs)、隱花色素(cryptochrome，CRYs)、核受體亞家族1組D成員(nuclear receptor subfamily 1 group D members，REVERBs)、RAR相關的孤兒受體(retinoic acidrelated orphan receptors，RORs)和Dbox結合蛋白(Dbox binding protein，DBP)[2]。BMAL1與CLOCK在細胞核內通過bHLH-PAS結構域形成異源二聚體復合物并與PER、CRY、REVERB和ROR的E-box元件結合促使其轉錄。PER/CRY復合物可抑制CLOCK及BMAL1的轉錄活性，形成負反饋調節(jié)系統(tǒng)[3]。此外，ROR和REVERBα的轉錄翻譯分別正性或負性調控BMAL1基因[4]。DBP的轉錄受BMAL1/CLOCK驅動并且與其共同激活PER1的轉錄[5]。

正常的晝夜節(jié)律是機體各項生理功能正常運轉的必要因素，晝夜節(jié)律紊亂可導致多種疾病的發(fā)生。研究發(fā)現，成骨/破骨細胞[6]、骨髓間充質干細胞[7]和髁突軟骨細胞[8]等均表達生物鐘基因，并呈現出典型的晝夜節(jié)律性震蕩。晝夜節(jié)律紊亂可導致骨質疏松[9]和骨關節(jié)炎[10]等。此外，晝夜節(jié)律紊亂和鐘基因異常可減緩兒童及青少年生長發(fā)育速率，造成頜骨發(fā)育不全[11]和機體發(fā)育遲緩[12]。BMAL1作為生物鐘基因的核心組成部分[13]，由于僅刪除BMAL1基因就足以消除細胞和整個動物的晝夜節(jié)律，被廣泛用作晝夜節(jié)律分子破壞的模型。因此，研究生物鐘基因BMAL1調控骨發(fā)育的相關作用及分子機制有助于探尋防治頜骨及全身骨發(fā)育障礙的新方法。本文就BMAL1基因調控頜骨及全身骨發(fā)育的研究進展作一綜述，分析生物鐘基因BMAL1調控骨發(fā)育可能的機制，探討其在頜骨及全身骨疾病中可能發(fā)揮的作用，以期為尋求新的治療策略提供潛在價值。

1 BMAL1基因在軟骨發(fā)育中的作用

1.1 BMAL1基因調控軟骨內成骨及軟骨細胞分化

在哺乳動物中，間充質干細胞分化為軟骨細胞后產生無血管的軟骨模型，最終礦化成骨，此過程稱為軟骨內骨化，主要出現在下頜骨髁突和四肢骨等處[14]。軟骨內骨化異?？蓪е聡乐氐墓趋腊l(fā)育不良，包括身材矮小和顱面畸形[15]。研究發(fā)現，大鼠髁突軟骨的生長發(fā)育出現顯著的晝夜節(jié)律現象，并且可能在白天增殖最為活躍[16]。進一步研究發(fā)現，BMAL1基因在髁突軟骨組織中具有晝夜節(jié)律性震蕩，且振幅隨小鼠年齡增長而減小[8]。Yu等[17]使用微正電子發(fā)射斷層掃描(PET)和計算機斷層掃描(CT)證實髁突軟骨中心的骨化具有晝夜變化，并且夜間軟骨內骨化代謝相對活躍。此外，BMAL1-/-小鼠下頜骨髁突的軟骨生成減少和軟骨內成骨延遲，并且BMAL1-/-小鼠胎兒出現了顱骨軟骨鈣化不足，下頜骨髁突較小和較短的表征[8]。與此一致的是，Samsa等[18]發(fā)現敲除BMAL1-/-的小鼠生長板關閉較早，體型較小等特征。

由于軟骨細胞分化是骨骼發(fā)育和軟骨內骨化的關鍵過程，因此在分化過程中，軟骨細胞生物鐘的特征和功能非常重要。研究發(fā)現[19]，軟骨細胞在分化過程中同樣存在晝夜節(jié)律性，在ATDC5Bmal1:luc細胞的成軟骨分化過程中，軟骨細胞分化標志物的表達水平顯著增加。而在ATDC5-PER1軟骨細胞中，堿性磷酸酶活性和軟骨分化標志物的表達均顯著下降[20]。結果表明，BMAL1能促進軟骨細胞分化及軟骨形成。此外，隨著BMAL1-/-小鼠年齡的增長，出現類似早衰的表型[21]。因此，BMAL1的缺失通過減少軟骨細胞的序貫分化而抑制軟骨生成和軟骨內成骨。

1.2 BMAL1基因調控軟骨發(fā)育的分子機制

刺猬信號通路(Hedgehog，Hh)在哺乳動物發(fā)育過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。敲除小鼠生長板軟骨的印度刺猬蛋白(India Hedgehog，Ihh)會降低堿性磷酸酶活性和軟骨細胞的礦物質沉積[22]。Takarada等[20]揭示了在ATDC5-BMAL1軟骨細胞中，Ihh的表達明顯增加，表明BMAL1基因可能通過Hh信號通路調控軟骨生成。研究發(fā)現[8]，敲除小鼠BMAL1基因可直接激活Hh信號的負性調控因子受體修補1(patch1，Ptch1)的轉錄，下調Hh信號來抑制髁突軟骨細胞的增殖和軟骨蛋白的產生。因此，可以合理推測BMAL1基因可能通過Hh信號通路調控髁突軟骨的發(fā)育。

Runt結構域相關轉錄因子2(Runt domain-related transcription factor 2，Runx2)調控成骨細胞和軟骨細胞分化并促進骨骼發(fā)育[23]。Runx2對軟骨膜前體細胞的成骨分化和骨齡成熟至關重要，若其發(fā)生雜合突變將會導致鎖骨顱骨發(fā)育不良，表現為牙齒異常和骨骼發(fā)育遲緩[24]。研究發(fā)現[25]，敲除小鼠軟骨細胞Runx2后髁突軟骨肥大層消失，軟骨基質蛋白多糖和肥大分化相關蛋白表達降低，表明Runx2的正常表達能夠協(xié)調和維持小鼠髁突軟骨細胞的分化。Reale等[26]證明小鼠大腦中Runx2表達具有晝夜節(jié)律性，且在BMAL1-/-小鼠中，Runx2表達的節(jié)律被消除。因此，可以推測BMAL1基因可能通過上調Runx2表達從而調控軟骨細胞的分化。

新近研究發(fā)現[27]，髁突作為下頜骨重要的生長區(qū)，存在于低氧微環(huán)境中，條件性敲除小鼠顳下頜關節(jié)(TMJ)破骨細胞HIF-1α基因后髁突嚴重畸形，伴有髁突長度縮短和纖維軟骨紊亂，其機制是HIF1α通過AMPK/TSC2信號通路加速破骨細胞形成，介導下頜髁突鈣化軟骨基質的降解及軟骨內骨化。由于缺氧誘導因子HIF1α與BMAL1都含有相似的PAS結構域[28]，在敲除BMAL1的生長板軟骨細胞后，HIF1α的表達明顯下降[10]。因此，BMAL1缺失可能通過減少HIF-1α表達造成髁突發(fā)育畸形。

2 BMAL1基因在骨形成中的作用

2.1 BMAL1基因調控膜內成骨及成骨細胞分化

膜內成骨主要發(fā)生于顱腔、上下頜骨及鎖骨等處[14]。研究發(fā)現，處于生長發(fā)育高峰期的青少年下頜骨中存在強烈的晝夜節(jié)律，并且BMAL1基因在下頜骨中出現明顯的晝夜節(jié)律變化。此外，在青少年下頜骨發(fā)育不良的患者中，BMAL1在下頜骨中的表達顯著下降，并且晝夜節(jié)律紊亂會造成小鼠下頜骨的體積和骨量減小[11]。Zhou等[29]通過敲除小鼠BMAL1基因后發(fā)現，下頜骨骨量和體積明顯減小。Samsa等[18]發(fā)現，BMAL1基因敲除小鼠的股骨骨量顯著減少，骨髓間充質干細胞(BMSCs)的成骨分化減少，此外隨著壽命的延長而逐漸減少，從而導致長骨發(fā)育不良。因此，BMAL1基因和晝夜節(jié)律在下頜骨生長和重塑過程中發(fā)揮成骨功能。

間充質干細胞存在于多種組織器官中，具有自我更新及多項分化潛能。將靜止的BMSCs暴露在地塞米松中，表現出明顯的晝夜節(jié)律性震蕩[7]。He等[30]研究表明，BMAL1可能通過Wnt信號通路促進來源于BMSCs的成骨細胞數量。此外，老年人骨量的減少是由于BMSCs向脂肪細胞分化所造成的，從而擾亂了成脂-成骨平衡[31]。目前研究表明BMAL1參與BMSCs的成骨分化，且BMAL1水平和BMSCs的增殖活性之間存在正相關關系[32]。

2.2 BMAL1基因在調控骨形成的分子機制

Wnt/β-catenin信號通路在成骨細胞的成熟過程中起著關鍵調控作用。研究發(fā)現[24]，敲除前成骨細胞中的β-catenin將會導致成骨分化停滯。Lin等[33]過表達BMAL1導致成骨細胞分化增加。盡管已有研究[34]證明，β-catenin是BMAL1基因的靶基因，但二者相互作用的具體機制尚不清楚。新近研究發(fā)現[35]，BMAL1-/-小鼠通過下調Rorα或上調Rev-erbα的表達來抑制Wnt/β-catenin信號通路，而這可能是BMSCs成骨分化的負向調節(jié)的機制。He等[30]發(fā)現Wnt信號抑制劑Dkk1在誘導成骨過程中，BMAL1和骨相關因子的表達均顯著下降。因此，經典Wnt途徑和BMAL1基因在促進成骨分化過程中具有協(xié)同作用。

轉化生長因子β(TGF-β)/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號是誘導骨形成的重要途徑，并且在哺乳動物發(fā)育過程中對骨骼的形成具有廣泛的作用[36]。Huang等[37]研究證明，BMAL1過表達增強了成骨相關基因BMP2表達，從而促進成骨細胞分化。Min等[38]研究結果表明，BMAL1通過調節(jié)MC3T3-E1細胞中BMP2的表達來促進成骨細胞的分化。

此外，Zhou等[29]減少小鼠BMSCs和MC3T3-E1細胞中的BMAL1的表達，發(fā)現OPG蛋白被高度下調，成骨能力明顯減小。Cha等[39]研究報道，BMAL1通過抑制YAP的表達以促進BMSCs的成骨。因此，為基于晝夜節(jié)律介導的基質細胞治療和骨組織再生提供了良好的臨床前景。

3 BMAL1基因在骨吸收中的作用

在巨噬細胞集落刺激因子1(CSF1)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)的調控下，破骨細胞由來自造血干細胞的單核前體細胞發(fā)展而來，并與成骨細胞共同確保骨骼的發(fā)育和持續(xù)重塑[40]。研究發(fā)現，破骨細胞相關基因組織蛋白酶K(CTSK)和活化T細胞核因子胞漿1(Nfatc1)表現出明顯的晝夜節(jié)律性[41]。Xu等[42]通過特異性敲除小鼠破骨細胞中BMAL1基因后，破骨細胞分化減少及高骨量表型。Takarada等[6]發(fā)現BMAL1-/-的小鼠成骨細胞具有更高的支持破骨細胞生成的能力。

破骨細胞在分化過程中，基質金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3，MMP3)已被證實可以抑制小鼠mBMSCs的成骨分化，以確保正常的骨形成過程。研究發(fā)現[11]，BMAL1的缺失可以通過p65磷酸化間接上調MMP3的表達，而有效促進破骨細胞的分化，最終導致骨質疏松及下頜骨發(fā)育不良。因此，MMP3可能是BMAL1的潛在目標。骨保護素(osteoprotegerin，OPG)通過阻止RANKL與其受體RANK的相互作用來抑制破骨細胞的形成和成熟[43]。研究表明[29]，BMAL1直接與OPG啟動子結合并上調其表達，從而抑制下頜骨破骨細胞的分化。此外，BMAL1的過表達抑制了NF-κB通路的活性，恢復了BMSCs的成骨能力而抑制了其誘導破骨細胞的能力[44]。Xie等[45]發(fā)現正畸力可誘導BMAL1表達增加，增強牙周膜干細胞中CCL2和RANKL的分泌水平，從而促進單核細胞的募集和破骨向分化，可作為加速正畸牙移動和控制病理性骨改建的潛在治療靶點。

4 BMAL1基因的異常表達與骨疾病

4.1 頜骨發(fā)育不良

頜骨的生長方式分為膜內成骨及軟骨內成骨。膜內成骨主要發(fā)生于上頜骨和下頜骨體，而軟骨內成骨則主要發(fā)生于下頜骨髁突軟骨。下頜骨髁突軟骨(mandibular condylar cartilage，MCC)屬于繼發(fā)性軟骨，作為一個區(qū)域性生長點，對顱面部發(fā)育起到繼發(fā)性、適應性反應，其生長偏差會造成下頜畸形、咬合干擾和顳下頜關節(jié)紊亂，進而影響顱面發(fā)育[46]。近年來，青少年正畸臨床患者比例居高不下，正合手術仍是面部骨性畸形的主要治療策略，但這種手術需患者成年后，并且不良反應嚴重。Yu等[8]通過體內動物實驗發(fā)現，Hh信號激活劑(SAG)注射液可能通過GLI1-RUNX2-Ihh信號軸在軟骨細胞中增加Ihh表達，明顯改善青春期前和青春期早期因BMAL1基因敲除引起的下頜骨量減少。因此，SAG可能是預防青春期及以前面部畸形的潛在候選新治療策略，但青春期以后注射SAG作用不明顯。Zhou等[29]研究報道，通過向小鼠腹膜內注射外源性OPG可顯著逆轉BMAL1基因敲除對破骨細胞分化的促進作用，從而逆轉因BMAL1基因敲除引起的骨丟失，為預防SMH提供了一種潛在的治療策略。

4.2 骨關節(jié)炎

骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以軟骨基質破壞、軟骨下骨硬化、骨贅形成、滑膜炎和關節(jié)軟骨吸收為特征的全身關節(jié)疾病[47]。研究發(fā)現，在小鼠OA軟骨細胞中，Per2表達升高，而BMAL1表達顯著降低[48]。通過靶向消融小鼠軟骨細胞中的BMAL1消除了其晝夜節(jié)律并導致關節(jié)軟骨進行性退化[49]。此外，缺氧和晝夜節(jié)律之間在基因組水平上互相串擾[50]。HIF-2α誘導與軟骨分化相關基因以及與軟骨退化相關基因的表達，因此，通過向關節(jié)內注射HIF-2α抑制劑可能是一個治療骨關節(jié)炎的策略[51]。近年來，由于顳下頜關節(jié)骨關節(jié)炎(TMJ-OA)可能會干擾兒童及青少年下頜骨的生長發(fā)育，導致牙頜面畸形而引起了人們的廣泛關注。Xie等[52]發(fā)現晝夜節(jié)律紊亂可導致大鼠TMJ出現OA樣損傷，表明晝夜節(jié)律紊亂是TMJ-OA的危險因素。進一步研究發(fā)現，過表達BMAL1可以減少細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)的磷酸化、抑制白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)，進而延緩TMJ-OA發(fā)展。此外，He等[53]研究發(fā)現，低強度脈沖超聲上調生物鐘基因PER-2的表達，抑制TMJ-OA血管內皮生長因子的表達來減少軟骨中的炎癥因子。

4.3 骨質疏松

骨質疏松是一種全身性骨骼疾病，主要發(fā)生于絕經后婦女，其特點為骨吸收大于骨形成，最終導致骨折的發(fā)生[54]。隨著社會的發(fā)展，全天候輪班工作造成晝夜生物鐘紊亂，表現為骨密度降低和骨折風險增加[55]。此外，骨質疏松癥還與衰老密切相關，這與BMAL1基因隨年齡的增長表達相一致。BMAL1過表達可恢復BMSCs的成骨能力，抑制了破骨誘導能力，改善了骨代謝和功能，從而延緩骨質疏松進程。據報道[9]，生物鐘基因BMAL1和PERs是骨代謝異常的治療靶點，為臨床上治療骨質疏松提供可行的治療思路。新近研究[39]發(fā)現，向老年小鼠股骨內注射注入BMAL1過表達劑和miR-142-3p抑制劑后，股骨干骺端的再生能力更強，顯示出更多的礦化沉積，并且骨量和骨小梁數量增加，顯著改善老年小鼠的骨質疏松癥。

5 總結與展望

綜上所述，BMAL1基因作為生物鐘基因的核心組成部分，廣泛參與并調控成骨細胞、軟骨細胞及破骨細胞的分化及骨形成過程。BMAL1基因異常表達可能造成頜骨發(fā)育不良、骨質疏松及骨關節(jié)炎等骨骼疾病。但近年來BMAL1基因調控骨發(fā)育的研究也具有一定局限性，有待進一步闡明。首先，核心生物鐘基因BMAL1常與CLOCK基因形成異二聚體后才發(fā)揮相應效應，此外還有CRY和PER的干擾，這也在一定程度上阻礙了對BMAL1基因功能的認識。其次，生物鐘基因BMAL1依賴性控制成骨細胞、軟骨細胞及破骨細胞的信號通路眾多，需厘清其中的核心信號通路及轉錄因子，對探索骨性錯合畸形及全身骨病的防治具有深遠意義。最后，盡管有研究證明了通過調控BMAL1基因在骨發(fā)育及代謝疾病的相關防治方法，但目前通過靶向生物鐘基因治療骨疾病的研究尚且罕見，需要進一步研究其作用。