周 靜，徐紅斌，周澤琳，周耀斌，符昌雨，劉 洋

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，國家市場監(jiān)管重點實驗室（乳及乳制品檢測與監(jiān)控技術(shù)），上海 200233）

環(huán)氧乙烷是一種廣譜殺菌劑，能殺滅各種微生物，例如芽孢、結(jié)核桿菌、細菌、病毒和真菌等[1]。環(huán)氧乙烷已被明確具有一定致癌性、誘變性和生殖毒性[2]，美國國立衛(wèi)生研究院將其定義為“已知的人類致癌物”[3]。世界多國已紛紛將環(huán)氧乙烷移出食品添加劑列表[4-5]。我國的《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）[6]中也明確規(guī)定，環(huán)氧乙烷不適用于食品滅菌。然而近幾年卻不斷發(fā)生因食品中檢出環(huán)氧乙烷的召回和預(yù)警事件，歐盟食品和飼料類快速預(yù)警系統(tǒng)已累計發(fā)布500 次以上通報，產(chǎn)品涉及20多個國家[7]。

食品中頻繁被檢出環(huán)氧乙烷，主要是由于目前仍有一些國家使用環(huán)氧乙烷作為熏蒸劑控制香料和食品等的蟲害。但冰淇淋等食品中檢出環(huán)氧乙烷，一方面可能來自于食品包裝的印刷油墨遷移。另外，受新冠肺炎疫情影響，部分國家使用環(huán)氧乙烷對食品原料及外包裝進行熏蒸消殺，可能導(dǎo)致原料或成品中發(fā)生殘留[8]。低濃度的環(huán)氧乙烷無法通過肉眼和嗅覺分辨，食品企業(yè)難以通過常規(guī)手段對含有環(huán)氧乙烷的原料進行管控。尤其是冷凍飲品、乳制品等不使用高溫加工工藝的產(chǎn)品，更容易有環(huán)氧乙烷殘留。另外，在使用環(huán)氧乙烷進行滅菌的過程中，殘留的環(huán)氧乙烷會與食品中的氯接觸后發(fā)生代謝反應(yīng)，生成2-氯乙醇[8-9]。

目前僅有歐盟、美國、加拿大、韓國等對環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇設(shè)有限量值。歐盟規(guī)定環(huán)氧乙烷與2-氯乙醇之和以環(huán)氧乙烷計，在各類食品中的限量為0.02～0.10 mg/kg，并于2020年發(fā)布了氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法[10]。美國、加拿大規(guī)定不同食品、藥品等中的環(huán)氧乙烷限量為7～50 mg/kg不等，2-氯乙醇小于940 mg/kg，美國環(huán)境保護署采用氣相色譜法檢測香料中環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇[11]。在韓國，環(huán)氧乙烷屬于未登記的農(nóng)藥，執(zhí)行0.01 mg/kg的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，補充設(shè)定了2-氯乙醇臨時限量標(biāo)準(zhǔn)，即農(nóng)畜水產(chǎn)品及其加工品≤30 mg/kg，嬰幼兒食品≤10 mg/kg。

國內(nèi)目前可供參考的環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇的檢測方法適用范圍主要集中在醫(yī)療器械類[12-15]、醫(yī)用口罩[16-18]、個人防護用品[19-21]、紡織品類[22-25]、藥品與藥品包裝材料[26-28]及食品接觸材料方面[29]。上述方法均采用氣相色譜儀或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行檢測，前處理方法基本采用頂空或吹掃捕集技術(shù)。對比歐美等食品基質(zhì)中的方法，美國將環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇分開測定，檢測效率不高；歐盟的方法前處理較復(fù)雜，采用程序升溫進樣口和四極桿串聯(lián)質(zhì)譜，對設(shè)備的配置要求很高，韓國的方法亦是如此[30]，因此目前仍無法在國內(nèi)推廣應(yīng)用。我國尚未制定可以廣泛適用于食品中環(huán)氧乙烷及2-氯乙醇的相關(guān)檢測和限量標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致出口食品存在極大的退運風(fēng)險[31]。雖有文獻報道了食品中環(huán)氧乙烷及2-氯乙醇的同步測定方法，但只集中于芝麻、香辛料和方便面[32-33]。對于如冰淇淋、低溫乳制品等不使用高溫加工工藝的食品較少涉及，有研究[34]報道了采用頂空-氣相色譜儀測定冰淇淋中環(huán)氧乙烷的方法，但該方法未實現(xiàn)2-氯乙醇的同步測定，且氣相色譜法的定性準(zhǔn)確度也不如質(zhì)譜法。因此本研究建立一種頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，以實現(xiàn)乳及乳制品中環(huán)氧乙烷及2-氯乙醇的同時測定，旨在為乳及乳制品中環(huán)氧乙烷滅菌殘留的判斷提供技術(shù)評價依據(jù)，進一步保障消費者飲食健康。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品：在當(dāng)?shù)爻匈徺I35 批次實驗樣品，包括液態(tài)乳（10 批次）、嬰幼兒配方乳粉（10批次）、低溫發(fā)酵乳（10 批次）和冰淇淋（5 批次）。

環(huán)氧乙烷（2 000 μg/mL，溶于水）、2-氯乙醇（1 000 μg/mL，溶于水）、BePure?標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)北京曼哈格生物科技有限公司；實驗用水：一級純水。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS QP2020 NX頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（帶有HS-20頂空進樣器） 日本島津公司；DENVER分析天平 美國Denver公司；SK8210LHC超聲儀上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；Vortex Genie 2渦旋混合器美國Scientific Industries公司；Milli-Q超純水器 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)混合中間液：吸取環(huán)氧乙烷標(biāo)準(zhǔn)溶液（2 000 μg/mL）0.05 mL和2-氯乙醇（1 000 μg/mL）0.50 mL于10 mL容量瓶中，加超純水定容至刻度，混勻并轉(zhuǎn)移至棕色儲液瓶中，于4 ℃冰箱冷藏避光保存。得到的標(biāo)準(zhǔn)混合中間液中環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度為10.0 mg/L，2-氯乙醇質(zhì)量濃度為50.0 mg/L。

標(biāo)準(zhǔn)混合系列工作液：分別吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.05、0.10、0.15、0.25、0.50、1.00 mL于5 mL容量瓶中，加空白樣品基質(zhì)，用超純水定容至刻度，混勻并轉(zhuǎn)移至頂空瓶中，及時壓蓋密封，現(xiàn)用現(xiàn)配。得到的標(biāo)準(zhǔn)混合系列工作液中環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0 mg/L，2-氯乙醇質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.5、5.0、10.0 mg/L。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 液態(tài)乳

用移液槍準(zhǔn)確吸取5.0 mL液態(tài)乳樣品于20 mL頂空進樣瓶中，為防止目標(biāo)物揮發(fā)，盡快用密封蓋壓緊密封，渦旋混勻。待上機分析。

1.3.2.2 嬰幼兒配方乳粉

稱取1.0 g左右嬰幼兒配方乳粉樣品于15 mL定容管中，先加入2 mL超純水溶解，超聲15 min，再加入超純水定容至5.0 mL，渦旋混勻，轉(zhuǎn)移至20 mL頂空進樣瓶中。同上操作，待分析。

1.3.2.3 冰淇淋、低溫發(fā)酵乳

取100～200 g樣品于均質(zhì)器中均質(zhì)，待用。移取上述均質(zhì)后的冰淇淋或低溫發(fā)酵乳樣品5.0 mL于20 mL頂空進樣瓶中，稱質(zhì)量，同上操作，待上機分析。

若是樣品性狀濃稠，則稱取3.0 g左右樣品于15 mL定容管中，加入少許超純水稀釋溶解，超聲5 min，最終用超純水定容至5.0 mL，渦旋混勻后轉(zhuǎn)移至20 mL頂空進樣瓶中。同上操作，待分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：DB-624石英毛細管柱（60 m×0.32 mm，1.8 μm）；進樣方式：分流進樣，分流比10∶1；進樣口溫度220 ℃；載氣：高純氦氣，純度≥99.999%；流速：恒流模式，1.0 mL/min；程序升溫：40 ℃保持3 min，然后以25 ℃/min程序升溫至240 ℃，保持5 min。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電離方式：電子轟擊電離源；電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；傳輸線溫度260 ℃；溶劑延遲3.0 min；掃描方式：選擇離子監(jiān)測（selected ion monitor，SIM）模式采集，SIM掃描離子見表1。

1.3.5 結(jié)果計算

樣品中環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇含量按下式計算。

式中：X為樣品中環(huán)氧乙烷或2-氯乙醇含量/（mg/kg）；ρ為由線性方程計算得到的試樣溶液中環(huán)氧乙烷或2-氯乙醇的質(zhì)量濃度/（mg/L）；ρ0為試樣空白溶液中環(huán)氧乙烷或2-氯乙醇的質(zhì)量濃度/（mg/L）；V為頂空瓶體積/mL；m為取樣量/g（mL）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

冰淇淋、低溫發(fā)酵乳和嬰幼兒配方乳粉樣品基質(zhì)較復(fù)雜，尤其還含有香精等揮發(fā)性成分，因此色譜柱的選型和分離條件的優(yōu)化至關(guān)重要。關(guān)于環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇的測定，文獻[32]比較了幾款常見的中等極性和極性色譜柱，得出結(jié)論，DB-624色譜柱（30 m×0.25 mm，1.4 μm）對環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇均有較好的保留。因此，本研究在全掃描模式下，進一步考察不同規(guī)格DB-624色譜柱對環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇的分離效果。同樣升溫程序條件下，DB-624色譜柱（30 m×0.25 mm，1.4 μm）對環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇的保留時間分別為2.01 min和5.95 min，環(huán)氧乙烷出峰較早，在這個時間段存在較多小分子的揮發(fā)性物質(zhì)及載氣背景干擾，不利于色譜分離與目標(biāo)物定量；而另一款DB-624色譜柱（60 m×0.32 mm，1.8 μm）對環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇有更好的保留，其保留時間分別為5.62 min和9.81 min，避免了大部分揮發(fā)性物質(zhì)的干擾（圖1）。因此，選擇DB-624色譜柱（60 m×0.32 mm，1.8 μm）作為最終的分析柱。

2.1.2 分流比的選擇

氣相色譜分流比條件的設(shè)定不僅是決定方法檢出限的重要影響因素，同時也會對目標(biāo)物出峰峰型及干擾等情況產(chǎn)生影響，從而影響積分和定量準(zhǔn)確性。因此本研究比較不同分流比條件下環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇的出峰情況。比較不分流與分流比10∶1、20∶1、50∶1的目標(biāo)物出峰情況，由圖2可知：在不分流條件下，化合物拖尾嚴重，且存在檢測器過飽和風(fēng)險；而分流比20∶1和50∶1條件下儀器響應(yīng)值較低，嚴重影響方法靈敏度，因此最終確定方法分流比設(shè)定為10∶1。

圖2 分流比對環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇色譜峰響應(yīng)的影響Fig.2 Effect of split ratio on chromatographic peak responses of ethylene oxide and 2-chloroethanol

2.2 頂空條件優(yōu)化

頂空進樣模式下，頂空的平衡時間和平衡溫度會直接影響方法的靈敏度，因此重點對這2 個參數(shù)條件進行實驗優(yōu)化。

2.2.1 頂空平衡溫度的確定

通過基質(zhì)加標(biāo)的手段考察不同頂空平衡溫度下目標(biāo)物的儀器出峰響應(yīng)變化。向液態(tài)乳空白樣品中添加1.0 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度2.0 mg/L、2-氯乙醇10.0 mg/L），保證液體體積為5.0 mL，密封后渦旋混勻，于50、60、70、80、90 ℃條件下平衡30 min（一般情況下，30 min平衡時間基本都能達到氣-液平衡）。由圖3可知，環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇的儀器響應(yīng)峰面積隨溫度升高而增大。這是由于對于易揮發(fā)性物質(zhì)而言，溫度越高越利于其從食品基質(zhì)中揮發(fā)釋放?？紤]到頂空瓶平衡溫度過高會出現(xiàn)水蒸氣和密封性等問題，同時還會出現(xiàn)乳制品中蛋白質(zhì)的變性問題，因此本研究中最高加熱至90 ℃。同時由于100 ℃已達到水的沸點，水的沸騰會擾亂頂空瓶中的氣-液平衡，影響實驗數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。在90 ℃溫度條件下，連續(xù)重復(fù)7 次實驗，結(jié)果偏差控制在10%以內(nèi)，滿足實驗靈敏度和穩(wěn)定性的測試要求。

圖3 頂空平衡溫度對環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇色譜峰面積的影響（nn==77）Fig.3 Effect of headspace equilibrium temperature onchromatographic peak areas of ethylene oxide and 2-chloroethanol (n = 7)

2.2.2 頂空平衡時間的確定

向液態(tài)乳空白樣品中添加1.0 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（環(huán)氧乙烷2.0 mg/L、2-氯乙醇10.0 mg/L），定容體積為5.0 mL，密封后渦旋混勻。頂空加熱溫度為90 ℃條件下，考察不同平衡時間對環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇響應(yīng)峰面積的影響。選取頂空平衡時間10、20、30、40 min 4 種條件下分別進樣。由圖4可知，環(huán)氧乙烷在20 min左右可達到基本的氣-液兩相平衡，20 min后即使平衡時間再延長，環(huán)氧乙烷的峰面積也無大的變化。而2-氯乙醇從10 min一直到40 min，其峰面積基本都處于穩(wěn)定狀態(tài)，說明2-氯乙醇的揮發(fā)較快，受頂空溫度的影響更大?？紤]到色譜分離時長及兼顧實驗的快速高效性，選擇最佳的頂空平衡時間為20 min。

圖4 頂空平衡時間對環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇色譜峰面積的影響（nn==77）Fig.4 Effect of headspace equilibrium time on chromatographic peak areas of ethylene oxide and 2-chloroethanol (n = 7)

3 方法學(xué)驗證

3.1 方法的線性范圍、檢出限及定量限

按照前述的儀器條件，對各質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定，以目標(biāo)峰面積響應(yīng)為縱坐標(biāo)，以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進行線性擬合。由表2可知，環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇分別在0.1～2.0 mg/L和0.5～10.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，環(huán)氧乙烷在液態(tài)乳、發(fā)酵乳和冰淇淋中的檢出限均為0.12 mg/kg，定量限均為0.40 mg/kg，在嬰幼兒配方乳粉中的檢出限均為0.60 mg/kg，定量限均為2.0 mg/kg，在半固體冰淇淋、半固體發(fā)酵乳中的檢出限均為0.20 mg/kg，定量限均為0.67 mg/kg。2-氯乙醇在液態(tài)乳、發(fā)酵乳和冰淇淋中的檢出限均為0.60 mg/kg，定量限均為2.0 mg/kg，在嬰幼兒配方乳粉中的檢出限均為3.0 mg/kg，定量限均為10.0 mg/kg，在半固體冰淇淋、半固體發(fā)酵乳中的檢出限均為1.0 mg/kg，定量限均為3.3 mg/kg。

表2 環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients,limits of detection and limits of quantification for ethylene oxide and 2-chloroethanol

3.2 回收率及精密度

在空白液態(tài)乳（牛乳）、嬰幼兒配方乳粉以及冰淇淋基質(zhì)中分別添加低、中、高3 個水平的環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇，按實驗步驟進行測定。由表3～5可知，加標(biāo)回收實驗結(jié)果顯示，不同基質(zhì)空白加標(biāo)回收率能達到75.9%～101.6%，變異系數(shù)均小于10%，方法精密度和準(zhǔn)確度良好，加標(biāo)檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，且方法靈敏度高，滿足乳粉復(fù)雜基質(zhì)的檢測與限量要求，符合實驗室分析基本要求。

表3 空白液態(tài)乳基質(zhì)加標(biāo)回收實驗結(jié)果（nn==77）Table 3 Recoveries of spiked blank milk matrix (n = 7)

表4 空白嬰幼兒配方乳粉基質(zhì)加標(biāo)回收實驗結(jié)果（nn==77）Table 4 Recoveries of spiked blank infant formula milk powder (n = 7)

表5 空白冰淇淋基質(zhì)加標(biāo)回收實驗結(jié)果（nn==77）Table 5 Recoveries of spiked blank ice cream (n = 7)

3.3 市售樣品測定

對采購的35 批次產(chǎn)品進行測定后，發(fā)現(xiàn)所有樣品中均未檢出環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇。在我國，將環(huán)氧乙烷用于食品消毒是被嚴格禁止的，上述檢測結(jié)果也證實了這一點，說明一般情況下消費者無需擔(dān)心這些產(chǎn)品中的環(huán)氧乙烷殘留問題。但是從食品安全監(jiān)管角度出發(fā)，為了控制食品安全風(fēng)險，對食品中環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇進行檢測及監(jiān)控仍然很有必要，尤其是對于某些地區(qū)的進口食品而言。

4 結(jié) 論

由實驗結(jié)果可知，用本實驗建立的方法測定乳及乳制品中環(huán)氧乙烷及其代謝物2-氯乙醇殘留量，樣品前處理過程簡單易操作，方法分析時長較短，揮發(fā)性目標(biāo)物不易損失，用DB-624毛細管柱（60 m×0.32 mm，1.8 μm）分離目標(biāo)峰出峰時間合理且附近無干擾峰出現(xiàn)。采用質(zhì)譜檢測定性、定量準(zhǔn)確且線性范圍寬，方法檢出限較低；低、中、高3 個水平加標(biāo)樣品測試也表現(xiàn)出較高的精密度和準(zhǔn)確度，滿足乳及乳制品中環(huán)氧乙烷和2-氯乙醇檢測分析要求。