趙娜，段志霞，王慧

(1.濟(jì)源職業(yè)技術(shù)學(xué)院 基礎(chǔ)部，河南 濟(jì)源 459000；2.南陽(yáng)理工學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473004)

醬油營(yíng)養(yǎng)豐富且具有獨(dú)特的風(fēng)味，含有多種氨基酸和有機(jī)化合物[1]。醬油是以大豆或植物蛋白為原材料，在米曲霉制曲發(fā)酵作用下生產(chǎn)而成，根據(jù)醬油生產(chǎn)工藝方法可將醬油分為高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油和低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油[2-3]。高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油的生產(chǎn)周期長(zhǎng)，生產(chǎn)成本較高；低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油的生產(chǎn)周期短，且原材料價(jià)格低廉[4-5]。響應(yīng)面分析法通過(guò)建立各影響因子和結(jié)果之間的函數(shù)關(guān)系，分析影響因子對(duì)結(jié)果的影響，尋找結(jié)果最優(yōu)的影響因子[6]。本文以非轉(zhuǎn)基因大豆為原材料，采用低鹽固態(tài)發(fā)酵的方法，結(jié)合響應(yīng)面進(jìn)行分析，對(duì)醬油發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高醬油發(fā)酵過(guò)程中的蛋白質(zhì)利用率。

1 試驗(yàn)測(cè)定與分析方法

采用凱氏定氮法對(duì)原材料中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)對(duì)不同發(fā)酵條件下所得到的醬油中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算出醬油發(fā)酵過(guò)程中的蛋白質(zhì)利用率[7]：

式中：η表示蛋白質(zhì)利用率；n表示成品醬油中的蛋白質(zhì)總量,g；m表示醬油原材料中的蛋白質(zhì)總量,g。

醬油發(fā)酵過(guò)程中影響因素主要包括米曲霉與黑曲霉體積比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間以及鹽水濃度[8-10]。本文分別在不同工藝條件下對(duì)醬油發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行單因素試驗(yàn)，醬油發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)見(jiàn)表1。

表1 醬油發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)Table 1 Single factor test for soy sauce fermentation conditions

在單因素試驗(yàn)完成后，對(duì)蛋白質(zhì)利用率進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算，確定米曲霉與黑曲霉體積比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間以及鹽水濃度對(duì)醬油發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)利用率的影響，并獲取發(fā)酵條件因素3個(gè)水平的最佳參數(shù)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)水平編碼表[11-12]。響應(yīng)面分析因素水平見(jiàn)表2。

表2 醬油發(fā)酵響應(yīng)面分析因素水平表Table 2 Factors and levels of soy sauce fermentation response surface analysis

2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 米曲霉與黑曲霉體積比對(duì)蛋白質(zhì)利用率的影響

米曲霉與黑曲霉體積比對(duì)蛋白質(zhì)利用率單因素試驗(yàn)的影響結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 米曲霉與黑曲霉體積比對(duì)蛋白質(zhì)利用率單因素試驗(yàn)的影響結(jié)果Table 3 Effect of volume ratio of Aspergillus oryzae to Aspergillus niger on single factor test of protein utilization rate

由表3可知，當(dāng)米曲霉與黑曲霉體積比從1∶3增加到2∶1時(shí)，原材料蛋白質(zhì)利用率隨著米曲霉與黑曲霉體積比的增加而升高，當(dāng)米曲霉與黑曲霉體積比為2∶1時(shí)，原材料蛋白質(zhì)利用率達(dá)到最高值85%，當(dāng)米曲霉與黑曲霉體積比大于2∶1時(shí)，隨著米曲霉與黑曲霉體積比的增加，原材料蛋白質(zhì)利用率逐漸降低。醬油發(fā)酵過(guò)程中，米曲霉可分泌出中性和堿性蛋白酶，黑曲霉可分泌出酸性蛋白酶，在不同的米曲霉與黑曲霉體積比條件下，二者蛋白酶配比不同，導(dǎo)致醬油發(fā)酵過(guò)程中原材料蛋白質(zhì)利用率不同。

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)蛋白質(zhì)利用率的影響

發(fā)酵溫度對(duì)蛋白質(zhì)利用率單因素試驗(yàn)的影響結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 發(fā)酵溫度對(duì)蛋白質(zhì)利用率單因素試驗(yàn)的影響結(jié)果Table 4 Effect of fermentation temperature on single factor test of protein utilization rate

由表4可知，當(dāng)發(fā)酵溫度從15 ℃升到45 ℃時(shí)，原材料蛋白質(zhì)利用率隨著溫度的升高而逐漸升高，當(dāng)發(fā)酵溫度為45 ℃時(shí)，原材料蛋白質(zhì)利用率達(dá)到最高值88%，當(dāng)發(fā)酵溫度大于45 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，原材料蛋白質(zhì)利用率逐漸降低。醬油發(fā)酵過(guò)程中，酶活力主要受溫度的影響，過(guò)高或過(guò)低的溫度均會(huì)使酶活力降低，對(duì)醬油發(fā)酵過(guò)程中原材料蛋白質(zhì)利用率產(chǎn)生不同程度的影響。

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)利用率的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)利用率單因素試驗(yàn)的影響結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)利用率單因素試驗(yàn)的影響結(jié)果Table 5 Effect of fermentation time on single factor test of protein utilization rate

由表5可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間從60 d增加到100 d時(shí)，原材料蛋白質(zhì)利用率隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為100 d時(shí)，原材料蛋白質(zhì)利用率達(dá)到最高值87%，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于100 d時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，原材料蛋白質(zhì)利用率逐漸降低。

2.4 鹽水濃度對(duì)蛋白質(zhì)利用率的影響

鹽水濃度對(duì)蛋白質(zhì)利用率單因素試驗(yàn)的影響結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 鹽水濃度對(duì)蛋白質(zhì)利用率單因素試驗(yàn)的影響結(jié)果Table 6 Effect of brine concentration on single factor test of protein utilization rate %

由表6可知，當(dāng)鹽水濃度從8%增加到12%時(shí)，原材料蛋白質(zhì)利用率隨著鹽水濃度的增加而逐漸升高，當(dāng)鹽水濃度為12%時(shí)，原材料蛋白質(zhì)利用率達(dá)到最高值87%，當(dāng)鹽水濃度大于12%時(shí)，隨著鹽水濃度的升高，原材料蛋白質(zhì)利用率逐漸降低。食鹽能夠有效抑制發(fā)酵過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)也會(huì)對(duì)酶活力產(chǎn)生影響，當(dāng)鹽水濃度過(guò)高時(shí)，蛋白酶活力降低，原材料蛋白質(zhì)利用率也隨之降低。

3 醬油發(fā)酵條件響應(yīng)面分析

在醬油發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)完成后，確定米曲霉與黑曲霉體積比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間以及鹽水濃度四因素三水平試驗(yàn)，對(duì)醬油發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 醬油發(fā)酵過(guò)程響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Response surface analysis test results of soy sauce fermentation process

續(xù) 表

由表7可知，醬油發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)利用率最高時(shí)所對(duì)應(yīng)的發(fā)酵條件為米曲霉與黑曲霉體積比2∶1、發(fā)酵溫度45 ℃、發(fā)酵時(shí)間100 d以及鹽水濃度12%，此時(shí)蛋白質(zhì)利用率可達(dá)到88.76%。利用Box-Behnken對(duì)表7中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，確定醬油發(fā)酵過(guò)程中4個(gè)因素的回歸方程為Y=88.35-6.35A2-0.34B2-4.39C2-9.18D2+1.03A-1.16B+0.52C+0.019D-0.92AB-1.39AC+0.052AD-0.91BC+0.21BD-0.02CD。

對(duì)二次響應(yīng)面回歸方程進(jìn)行分析，確定模型方差和回歸系數(shù)的顯著性，P<0.01表示該分析項(xiàng)極顯著[14]?；貧w方程方差分析結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 回歸方程方差分析結(jié)果Table 8 Results of variance analysis of regression equation

由表8可知，在醬油發(fā)酵過(guò)程中，蛋白質(zhì)利用率的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)為極顯著，表明醬油發(fā)酵過(guò)程中的4個(gè)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系不是一次線性關(guān)系，醬油發(fā)酵過(guò)程中的4個(gè)因素相互作用，構(gòu)成醬油發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)利用率響應(yīng)曲面結(jié)果。蛋白質(zhì)利用率的回歸項(xiàng)極顯著，表明二次響應(yīng)面回歸方程具有較好的擬合程度，因此醬油發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)過(guò)程具有較高的可信性和準(zhǔn)確性。蛋白質(zhì)利用率的失擬項(xiàng)不顯著，表明醬油發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)過(guò)程誤差較小。

利用Design-Expert繪制醬油發(fā)酵過(guò)程中米曲霉與黑曲霉體積比(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)以及鹽水濃度(D)4個(gè)因素對(duì)蛋白質(zhì)利用率的響應(yīng)面圖。米曲霉與黑曲霉體積比和發(fā)酵溫度對(duì)醬油發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)利用率影響的響應(yīng)面見(jiàn)圖1，米曲霉與黑曲霉體積比和發(fā)酵時(shí)間對(duì)醬油發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)利用率影響的響應(yīng)面見(jiàn)圖2，米曲霉與黑曲霉體積比和鹽水濃度對(duì)醬油發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)利用率影響的響應(yīng)面見(jiàn)圖3，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)醬油發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)利用率影響的響應(yīng)面見(jiàn)圖4，發(fā)酵溫度和鹽水濃度對(duì)醬油發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)利用率影響的響應(yīng)面見(jiàn)圖5，發(fā)酵時(shí)間和鹽水濃度對(duì)醬油發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)利用率影響的響應(yīng)面見(jiàn)圖6。

圖1 米曲霉與黑曲霉體積比和發(fā)酵溫度對(duì)蛋白質(zhì)利用率影響的響應(yīng)面Fig.1 Response surface diagram of effect of volume ratio of Aspergillus oryzae to Aspergillus niger and fermentation temperature on protein utilization rate

圖2 米曲霉與黑曲霉體積比和發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)利用率影響的響應(yīng)面Fig.2 Response surface diagram of effect of volume ratio of Aspergillus oryzae to Aspergillus niger and fermentation time on protein utilization rate

圖3 米曲霉與黑曲霉體積比和鹽水濃度對(duì)蛋白質(zhì)利用率影響的響應(yīng)面Fig.3 Response surface diagram of effect of volume ratio of Aspergillus oryzae to Aspergillus niger and brine concentration on protein utilization rate

圖4 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)利用率影響的響應(yīng)面Fig.4 Response surface diagram of effect of fermentation time and fermentation temperature on protein utilization rate

圖5 發(fā)酵溫度和鹽水濃度對(duì)蛋白質(zhì)利用率影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface diagram of effect of fermentation temperature and brine concentration on protein utilization rate

由圖1～圖6可知，醬油發(fā)酵過(guò)程中米曲霉與黑曲霉體積比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間以及鹽水濃度4個(gè)因素對(duì)蛋白質(zhì)利用率響應(yīng)值的敏感程度不同，其中米曲霉與黑曲霉體積比對(duì)蛋白質(zhì)利用率響應(yīng)值的影響最顯著，發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)利用率響應(yīng)值的影響強(qiáng)于發(fā)酵溫度，鹽水濃度對(duì)蛋白質(zhì)利用率響應(yīng)值的影響最弱。

根據(jù)分析結(jié)果確定，在醬油發(fā)酵過(guò)程中，最佳發(fā)酵工藝條件為米曲霉與黑曲霉體積比2∶1、發(fā)酵溫度45 ℃、發(fā)酵時(shí)間100 d以及鹽水濃度12%，此時(shí)蛋白質(zhì)利用率最高。并以此條件構(gòu)建醬油發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，同一發(fā)酵條件共進(jìn)行3組試驗(yàn)，并計(jì)算醬油發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)利用率。醬油發(fā)酵最佳條件試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 醬油發(fā)酵最佳條件試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Table 9 Experimental verification results of the optimum conditions for soy sauce fermentation

由表9可知，對(duì)以響應(yīng)面確定的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證時(shí)，醬油發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)利用率可達(dá)到88.99%，3組試驗(yàn)所得蛋白質(zhì)利用率相對(duì)誤差為0.35%，表明該二次響應(yīng)面回歸方程與實(shí)際發(fā)酵過(guò)程之間具有較好的擬合性，能夠用于醬油發(fā)酵過(guò)程條件的優(yōu)化和指導(dǎo)。

4 結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)的方式獲取醬油發(fā)酵過(guò)程中因素水平變化范圍，并設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析過(guò)程中的3個(gè)水平試驗(yàn)條件因素，利用Design-Expert對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，確定醬油發(fā)酵過(guò)程的最佳工藝條件。本試驗(yàn)有效提高了醬油發(fā)酵過(guò)程中的蛋白質(zhì)利用率，改善了醬油風(fēng)味，為醬油的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。