丁越越 孫華潔 劉妍妍 劉芯吟 陳智淵 葉黎青 馬紅珍

腎性貧血（renal anemia，RA）是慢性腎臟?。╟hronic kidney disease,CKD）臨床常見并發(fā)癥，嚴(yán)重的RA會使CKD患者發(fā)生心血管事件的概率增加、引起認(rèn)知功能障礙，是腎病患者進(jìn)入至終末期腎病的獨(dú)立危險因素之一[1]。有研究顯示CKD 3期貧血發(fā)生率為51.1%，CKD 5期可高達(dá)90.2%[2]。RA的主要治療方式為補(bǔ)充鐵劑、使用紅細(xì)胞生成刺激劑（erythropoietin stimulating agents,ESA）和輸血等，近年來，口服的新藥羅沙司他通過可逆地結(jié)合和抑制缺氧誘導(dǎo)因子-脯氨酸羥化（HIF-prolyl hydroxylase，HIF-PH）酶抑制劑，減少HIF分解，改善RA。但RA仍面臨治療率不高、達(dá)標(biāo)率低、ESA低反應(yīng)性等難題。中醫(yī)認(rèn)為血液化生與腎臟息息相關(guān)，有“腎藏精，精者，血之所成也”“腎為水臟，主藏精而化血”之說。RA在中醫(yī)學(xué)中歸屬于“腎勞”“虛勞”等病，其根本病機(jī)是腎衰竭時期，濕濁毒瘀邪留滯于機(jī)體，耗損正氣，導(dǎo)致腎臟元陰元陽俱損，精血化生不足[3]。當(dāng)歸性溫，味甘、辛，補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛。相關(guān)研究表明，當(dāng)歸的主要成分當(dāng)歸多糖（angelica sinensis polysaccharide，ASP）可以抑制CKD貧血大鼠肝臟鐵調(diào)素的表達(dá)，增加HIF-2α蛋白的積累，恢復(fù)促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin,EPO）的合成，激活JAK2/STAT5和PI3K/Akt信號傳導(dǎo)，發(fā)揮改善貧血的作用[4-5]。雞血藤性溫，味苦、甘，活血補(bǔ)血，活絡(luò)止痛，雞血藤可通過調(diào)控hepcidinncoding基因來抑制機(jī)體鐵調(diào)素的過表達(dá)，改善鐵代謝，糾正貧血[6]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，全面整理“當(dāng)歸-雞血藤”藥對治療RA潛在的作用機(jī)制，并利用分子對接對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行佐證，探究其對RA的作用機(jī)制，為臨床提供新的用藥思路。

1 對象和方法

1.1 化合物與靶點(diǎn)獲取 以“當(dāng)歸”“雞血藤”為關(guān)鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫中檢索其活性成分。以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，獲取符合條件的活性成分靶點(diǎn)導(dǎo)入Uniport數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化基因名。

1.2 RA靶點(diǎn)的獲取 將“Renal Anemia”設(shè)置為關(guān)鍵詞，分別在Drugbank、Genecards、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索RA相關(guān)靶標(biāo)，合并、去重，與中藥藥物靶點(diǎn)取交集，得到中藥治療RA的潛在作用靶點(diǎn)，并繪制Venn圖。

1.3 蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction,PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將潛在作用靶點(diǎn)上傳至String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）獲取靶點(diǎn)蛋白的交互作用信息，導(dǎo)入Cytoscape軟件，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape 3.6.0軟件，將“當(dāng)歸-雞血藤”藥對的潛在作用靶點(diǎn)與疾病之間的關(guān)聯(lián)通過網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化處理。

1.5 潛在作用靶點(diǎn)的基因本體（gene ontolog,GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路注釋分析 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫對“當(dāng)歸-雞血藤”藥對治療RA的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路注釋分析，繪制氣泡圖。

1.6 分子對接 通過PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org）下載蛋白結(jié)構(gòu)，PubChem數(shù)據(jù)庫下載（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）活性成分三維結(jié)構(gòu)。利用Autodock Vina(v1.1.2)以及Pymol軟件對結(jié)果進(jìn)行分析和可視化。

2 結(jié)果

2.1 藥物篩選結(jié)果 獲得2個當(dāng)歸活性成分，24個雞血藤活性成分，按照篩選條件進(jìn)行篩選、整合，去重后共獲得24個活性成分（有2個活性成分重復(fù)）。通過Uniport數(shù)據(jù)庫篩選獲得“當(dāng)歸-雞血藤”靶基因140個。

2.2 RA靶點(diǎn)的收集 通過檢索GeneCards、OMIM、Drugbank數(shù)據(jù)庫篩選獲得疾病靶點(diǎn)992個，將藥物與疾病靶點(diǎn)取交集，獲得交集靶點(diǎn)共44個，繪制Venn圖，見圖1。

圖1 藥物和疾病靶點(diǎn)Venn圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將44個交集靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，應(yīng)用Cytoscape3.6.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，通過Network Analyzer進(jìn)行分析。共同靶點(diǎn)出現(xiàn)頻次越高，度值越高。其中度值排名靠前的分別是MAPK1、TP53、TNF、CASP3、AKT1、STAT3，見表1。

2.4 藥物-活性成分-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建中藥-成分-疾病靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)，共獲得165個節(jié)點(diǎn)與446條邊，見圖2（插頁）。其中節(jié)點(diǎn)分別代表中藥、成分、疾病靶點(diǎn)，邊代表中藥-成分-靶點(diǎn)之間的相互聯(lián)系。箭頭代表藥物，正方形方格代表活性成分，菱形方格代表作用靶點(diǎn)。度值排名靠前的關(guān)鍵化合物為木犀草素（luteolin，LUT）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，BS）、刺芒柄花素（formononetin，F(xiàn)NN）、甘草查爾酮 A（licochalcone A，Lico A）等。

圖2 當(dāng)歸-雞血藤的“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO富集分析和KEGG通路注釋分析 根據(jù)P值選擇前20條生物過程、分子功能和細(xì)胞組分以及KEGG通路分別繪制氣泡圖，結(jié)果見圖3、4（插頁）。其中GO富集分析共得到GO生物過程361個條目，分子功能49個條目，細(xì)胞組分30個條目。

圖3 GO生物功能富集分析（A：GO生物過程分析；B：GO細(xì)胞組分分析；C：GO分子功能分析）

KEGG通路注釋分析到99條信號通路，關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的通路主要涉及HIF-1信號通路、PI3K/Akt信號通路、TNF信號通路等，見圖4（插頁）。

圖4 KEGG通路富集分析

2.6 分子對接驗證 將“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中根據(jù)度值大小排名前幾位化合物和與其相關(guān)的作用靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，得到分子對接熱圖見圖5（插頁），圖中顏色越深代表結(jié)合能越低。結(jié)果顯示，LUT和STAT3的最低結(jié)合能達(dá)-8.1，靶點(diǎn)與成分的結(jié)合具有強(qiáng)烈的穩(wěn)定性。以結(jié)合較好的兩組成分，LUT和STAT3以及LUT和TP53為例，進(jìn)行受體-配體相互作用分析，結(jié)果表明受體蛋白與小分子配體之間以氫鍵起結(jié)合作用，見圖6（插頁）。

圖5 分子對接熱圖

圖6 分子對接模式圖（A：TP53和LUT；B：STAT3和LUT）

3 討論

RA發(fā)生機(jī)制可能與巨噬細(xì)胞內(nèi)鐵釋放障礙、鐵吸收異常、EPO表達(dá)異常等有關(guān)。RA會影響腎病患者生存質(zhì)量，加速終末期腎臟病的進(jìn)程并增加CKD患者心血管意外發(fā)生率等。對RA合理治療可以改善患者的生存質(zhì)量[7]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，獲得“當(dāng)歸-雞血藤”藥對的有效化合物成分24種，與疾病靶點(diǎn)關(guān)系密切的關(guān)鍵化合物L(fēng)UT、BS、FNN、Lico A等。LUT抗炎活性強(qiáng)，同時可抗氧化、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可通過激活Nrf2通路，增加細(xì)胞抗氧化防御能力；調(diào)節(jié)HIF-1α通路，促使血管生成和上皮修復(fù)，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[8]。BS具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等生物活性，可下調(diào)TNF-α和IL-6的水平改善腎組織氧化應(yīng)激[9]。FNN和Lico A均可改善機(jī)體氧化應(yīng)激，其中Lico A還涉及調(diào)控HIF-1α蛋白表達(dá)[10-11]。

藥物潛在作用靶點(diǎn)共44個，通過PPI網(wǎng)絡(luò)得到與RA關(guān)系密切的核心蛋白，主要包括MAPK1、TP53、TNF、CASP3、AKT1、STAT3等靶點(diǎn)。MAPK1是絲分裂原活化蛋白激酶的一種，在細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡過程中都具有調(diào)節(jié)作用，其可通過改善氧化應(yīng)激緩解缺氧引起的腎纖維化[12]。TNF-α作為造血抑制因子，可激活炎癥應(yīng)答、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等，而炎癥則會抑制EPO，影響CKD患者的紅細(xì)胞生成和增殖和鐵的利用[13]。TP53作為TGF-β1誘導(dǎo)的信號通路中的輔助因子，是可以和TGF-β1促纖維化反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子，上調(diào)TP53可緩解腎纖維化，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化[14]。線粒體中AKT1的抑制會加重腎小管損傷、腎纖維化、腎小球硬化，反之可防止AKI和隨后CKD的發(fā)展[15]。STAT3是JAK/STAT信號級聯(lián)的核心成員，抑制STAT3具有減少蛋白尿，改善間質(zhì)纖維化的作用[16]。

GO富集分析結(jié)果表明，“當(dāng)歸-雞血藤”藥對主要通過細(xì)胞外隙、細(xì)胞溶質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜外等細(xì)胞組分介導(dǎo)對細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控、對基因表達(dá)的正調(diào)控、對RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等生物過程，發(fā)揮相同蛋白結(jié)合、細(xì)胞因子活性、酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能，從而治療RA。KEGG注釋分析獲得可能涉及的信號通路共99條，其中HIF-1信號通路直接參與造血，HIF是一種對機(jī)體氧水平至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，其通過Hb調(diào)節(jié)全身氧的輸送。調(diào)節(jié)HIF的亞基——HIF-1α可促進(jìn)腎臟內(nèi)源性EPO生成，同時HIF可增加鐵吸收、鐵儲存的可及性和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)，降低鐵調(diào)素的表達(dá)可改善炎癥反應(yīng)、提高機(jī)體的鐵利用，改善RA[17]。PI3K/Akt信號通路主要涉及細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物過程，激活該通路可上調(diào)GSK-3β/Nrf2通路并抑制ASK1/JNK信號通路，具有改善腎臟氧化應(yīng)激和炎癥的作用[18]。TNF-α信號通路參與炎癥反應(yīng)，活化TNF-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可誘導(dǎo)激活腎組織的炎性浸潤，成纖維細(xì)胞增生分化，調(diào)控TNF-α信號通路有助于減輕機(jī)體炎癥狀態(tài)，改善RA，同時也可能誘導(dǎo)應(yīng)激性紅細(xì)胞生成以維持紅細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[19]。總之，“當(dāng)歸-雞血藤”藥對治療RA主要通過多個成分和多靶點(diǎn)激活多條途徑促進(jìn)紅細(xì)胞生成，調(diào)控機(jī)體炎癥狀態(tài)，改善鐵利用發(fā)揮作用，從而改善RA，尤其對處于微炎癥狀態(tài)、ESA低反應(yīng)性的CKD貧血患者的療效有待進(jìn)一步研究。

分子對接結(jié)果顯示，STAT3和LUT的配體-受體復(fù)合物最低結(jié)合能可達(dá)-8.1，靶點(diǎn)與成分的結(jié)合具有強(qiáng)烈的穩(wěn)定性。一般認(rèn)為結(jié)合能越低，結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，相互作用的可能性越大[20]。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對“當(dāng)歸-雞血藤”藥對治療RA的具體機(jī)制進(jìn)行探討，分子對接結(jié)果在理論層面上初步驗證了預(yù)測的核心成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，為后續(xù)研究“當(dāng)歸-雞血藤”藥對治療RA的相關(guān)機(jī)制及臨床應(yīng)用提供了理論支持和科學(xué)依據(jù)。