張蓓 李國(guó)文

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)市中西醫(yī)結(jié)合臨床醫(yī)學(xué)院 上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科 上海 200082）

參葛顆粒為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院內(nèi)制劑，由丹參、葛根、炒白術(shù)、片姜黃、垂盆草、女貞子等組方，方中丹參活血化瘀；葛根清熱生津、升清排濁；白術(shù)健脾益氣、燥濕利水；姜黃芳香健胃，可活血行氣；垂盆草清熱利濕退黃；女貞子養(yǎng)陰益腎、補(bǔ)氣舒肝，諸藥配伍，共奏健脾祛痰、化濕活血之效。前期藥理實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明參葛顆粒對(duì)非酒精性脂肪肝病有較好的療效[1-2]。目前用于治療此病的中藥方劑眾多，常用的主要方劑有健脾疏肝方、健脾化痰方、疏肝調(diào)脂方、益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方及一些自擬方劑[3]。研究表明參葛顆粒能夠顯著降低患者血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶水平（P＜0.05），具有保肝降酶的作用；還可明顯降低血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平（P＜0.05），說明其能夠改善脂質(zhì)代謝，還能夠有效改善中醫(yī)證候積分，緩解臨床癥狀（P＜0.05）[1]。參葛顆粒能增加血清脂聯(lián)素水平，激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號(hào)，增加PGC1-α及Nrf2表達(dá)水平，發(fā)揮抗氧化作用。這可能是參葛方治療非酒精性脂肪性肝炎的作用機(jī)制之一[4]。方中姜黃，炒白術(shù)的主要有效成分為揮發(fā)油，由于這類成分具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，故采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油后，藥渣與其他藥材合并提取。丹參的水溶性酚酸類成分[5]、葛根中所含異黃酮類化合物均為其有效成分[6]，應(yīng)對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行有效控制。本方藥味多、劑量大，為了最大限度地減少浸膏量，提高有效成分的含量，對(duì)參葛顆粒水提及乙醇沉淀工藝參數(shù)進(jìn)行研究，結(jié)合實(shí)際條件，確定最佳水提及純化工藝條件[7]。本實(shí)驗(yàn)以水為溶媒進(jìn)行有效成分的提取，并采用乙醇沉淀的方式進(jìn)行純化，以期為該中藥制劑的臨床推廣提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；Kromasil 100-5 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm，Akzo Nobel公司）；Senco R206B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；Sartorius CPA225D 電子天平（賽多利斯公司）；3K18型小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 試藥

丹參、葛根、炒白術(shù)、片姜黃、垂盆草、女貞子均購于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心鑒定均符合2020年版《中國(guó)藥典》的標(biāo)準(zhǔn)；丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)11562-200908）、葛根素對(duì)照品（批號(hào)110752-200511）均購自中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙腈和甲醇（色譜級(jí)，霍尼韋爾公司）；純化水自制；其余試劑均為市售分析純。

1.3 方法

1.3.1 丹酚酸B測(cè)定

1）對(duì)照品溶液的配制 取適量丹酚酸B對(duì)照品，精密稱定，以75%甲醇制成每1 mL含45 μg的溶液。

2）供試品溶液的配制 精密移取濃縮液0.5 mL，以75%甲醇溶解并定容至50 mL，離心（13 000 r/min，10 min）后取上清液作為供試品溶液。

3）色譜條件 流動(dòng)相為甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）；檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm；柱溫40 ℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 葛根素測(cè)定

1）對(duì)照品溶液的配制 葛根素對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇配制成1 mL含20 μg的溶液。

2）供試品溶液的配制 精密移取提取液0.25 mL于50 mL容量瓶中，以25%甲醇稀釋至刻度，取少量溶液離心（13 000 r/min，10 min）后吸取上清液作為供試品溶液。

3）色譜條件 流動(dòng)相為甲醇-0.01% KH2PO4（28∶72）；體積流量1.0 mL/min；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3 工藝優(yōu)化

1）水提工藝的優(yōu)化 以浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間為考察因素，以丹酚酸B和葛根素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行水提工藝條件的優(yōu)選。

2）純化工藝的優(yōu)化 取水提液加入95%乙醇，考察不同濃度乙醇及沉淀次數(shù)對(duì)丹酚酸B、葛根素純化的影響，并測(cè)定其含量加權(quán)值，以二成份加權(quán)值為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 水提工藝研究

2.1.1 藥材浸泡時(shí)間的考察

按處方量稱取丹參、葛根、女貞子、垂盆草、片姜黃與炒白術(shù)藥渣（片姜黃，炒白術(shù)已提前加熱回流提取揮發(fā)油），加入其12倍量水，每隔15 min觀察藥材的浸潤(rùn)程度。結(jié)果顯示，浸泡0.5 h時(shí)，藥材基本浸潤(rùn)透，故浸泡時(shí)間為0.5 h。

2.1.2 水提工藝條件優(yōu)選

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以第一次提取時(shí)間，第二、三次提取時(shí)間，加水量為考察因素，每個(gè)因素確定3個(gè)水平，選取正交表L9（34）（表1、2），以丹酚酸B和葛根素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)水提工藝進(jìn)行優(yōu)選。

表1 因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)極差值大小，影響因素順序?yàn)镃＞A＞B即加水量＞第一次提取時(shí)間＞第二、三次提取時(shí)間。方差分析結(jié)果顯示加水量對(duì)加權(quán)值有顯著性差異（表3），其中水平1的試驗(yàn)指標(biāo)平均值最大，故加水量為12倍。而第一次提取時(shí)間和第二、三次提取時(shí)間對(duì)其無顯著性差異，采用直觀分析，根據(jù)極差值和試驗(yàn)指標(biāo)值，選擇第一次提取時(shí)間為1.5 h，第二、三次提取時(shí)間在隨機(jī)誤差范圍內(nèi)，出于節(jié)約時(shí)間和能源考慮，選擇0.5 h。綜合考慮，確定最佳工藝條件為A2B1C1，即第一次提取時(shí)間為1.5 h，第二、三次提取時(shí)間為0.5 h，加水量為藥材質(zhì)量的12倍。

表3 正交試驗(yàn)方差分析

2.1.4 驗(yàn)證

進(jìn)行3批提取驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，平均得膏率為29.83%，二成份加權(quán)值的平均值為4.21 mg/mL（表4）。其得膏率與二成份加權(quán)值正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，說明該提取工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 純化工藝研究

2.2.1 純化方式的考察

取水提液32.5 mL，共5份。加入95%乙醇至含乙醇濃度分別為65%，70%，75%，80%，85%，靜置過夜，過濾，濾液濃縮至32.5 mL。測(cè)定丹酚酸B、葛根素含量，計(jì)算加權(quán)值。取濃縮液各20 mL真空干燥，計(jì)算得膏率。結(jié)果表明，得膏率以乙醇濃度85%時(shí)最小、70%最大；丹酚酸B、葛根素含量的加權(quán)值隨著乙醇濃度的升高變化不大?？紤]到節(jié)約成本，確定沉淀用乙醇濃度為65%（表 5）。

表5 乙醇濃度對(duì)丹酚酸B和葛根素提取的影響

2.2.2 乙醇沉淀次數(shù)考察

分別測(cè)定乙醇沉淀1次、2次、3次備用液中丹酚酸B、葛根素含量，并計(jì)算加權(quán)值。各取20 ml真空干燥，計(jì)算得膏率。結(jié)果表明，得膏率隨著乙醇沉淀次數(shù)的增多而減小；其丹酚酸B、葛根素加權(quán)值也隨著乙醇沉淀次數(shù)的增加而降低。以二成份加權(quán)值為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合分析，確定乙醇沉淀次數(shù)為一次（表6）。

表6 乙醇沉淀次數(shù)對(duì)丹酚酸B和葛根素提取的影響

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取1倍量處方藥材（65 g），按上述方法和最佳工藝條件進(jìn)行3批提取驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，用最佳提取工藝進(jìn)行三份驗(yàn)證試驗(yàn)，其得膏率和加權(quán)值均與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，說明該提取工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。綜上所述，確定最佳乙醇沉淀工藝為：用65%乙醇沉淀1次（表7）。

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

3 討論

本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)對(duì)水提和乙醇沉淀純化工藝進(jìn)行選擇，此試驗(yàn)次數(shù)少，效果好。但考慮到實(shí)際生產(chǎn)中的成本、可行性、效率等，所以最后確定工藝參數(shù)并不一定是目前理論上的最佳選擇，往往需要根據(jù)實(shí)際情況，進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整[8]。

參葛顆粒方由多味藥組成，化學(xué)成分復(fù)雜，含丹酚酸B、異黃酮成分葛根素、糖類等多種成分。本方中脂溶性與水溶性成分都較多[9-10]。其中白術(shù)與片姜黃主要有效成分為揮發(fā)油，在制劑中易揮發(fā)，失去其功用，故在水提工藝前[11]，采用水蒸氣蒸餾法對(duì)炒白術(shù)、片姜黃中的揮發(fā)油進(jìn)行提取[12]，提取后的藥渣在水提工藝中和方中所有藥味一起提取，過程中不會(huì)造成處方中成分的流失，也不影響處方的工藝參數(shù)。本試驗(yàn)優(yōu)選出的參葛顆粒最佳水提和純化工藝穩(wěn)定，具有良好的重現(xiàn)性和可操作性，可為實(shí)際生產(chǎn)提供參考。