宋軍霞,祁紅兵，顏思宏

(1.嶺南師范學院地理科學學院，廣東湛江 524048；2.嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東湛江 524048)

近年來，隨著免疫功能下降人群的不斷增多，細菌、真菌感染率大幅上升，伴隨耐藥現象的出現，臨床可供選擇的抗菌藥物越來越有限[1]。黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)作為中醫(yī)中比較常見的一味中藥，不僅有著較強的抑菌作用，而且黃芩對有耐藥性的細菌也有較好的抑菌作用，如對耐藥性大腸桿菌的抑菌效果明顯優(yōu)于側柏葉、大薊、艾葉、石菖蒲、夏枯草5種中草藥的提取物[2]。

黃芩是傳統(tǒng)的中藥，但其生理保健功能卻越來越引起人們的重視，中國藥監(jiān)部門認定黃芩為藥食兩用植物，可作為保健食品的主要成分[3-4]，《神農本草經》中曰:黃芩主諸熱黃疸，腸泄痢，逐水下血閉，惡瘡疽蝕火腸。黃芩也被稱為山茶根、黃芩茶，為唇形科植物，多年生草本，主根長大，略呈圓錐狀，外皮褐色，該藥物主要具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等作用[5-8]，常用于濕溫、暑溫胸悶嘔惡、濕熱痞滿、瀉痢、黃疸、肺熱咳嗽、高熱煩渴、血熱吐衄、癰腫瘡毒、胎動不安等[9-13]。現代藥理學的相關研究表明，黃芩具有抗氧化、抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗變態(tài)反應、抗血小板聚集及抗凝、降血脂等作用[14-18]。

有研究表明，100%黃芩浸出液濾紙片對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、綠膿桿菌、乙型鏈球菌都有明顯的抑菌作用[19]。純化后的多糖對大腸桿菌的抑制活性最強,對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的最小抑菌濃度分別為0.625、0.625、1.250 mg/mL[20]。黃芩有效成分黃芩苷對大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)為1.56 g/L，且黃芩苷的抑菌能力高于黃芪皂苷[21]；蔣獻等[22]研究了黃芩浸膏和一清膠囊(主要成分是黃芩)對表皮葡萄桿菌(Staphylococcusepidermidis,Se)和痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes,Pra)的體外抑菌作用，結果發(fā)現，黃芩浸膏和一清膠囊對Se和Pra的MIC均分別為1.00、0.98 g/L， 表明黃芩對Se和Pra均有顯著的抑菌效果。該研究選用同一產地的黃芩，采用系統(tǒng)分離法對其有效化學成分進行提取，針對其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的活性抑制作用效果進行比較分析，旨在對中藥黃芩的有效化學成分及其抑菌作用進行分析，使臨床充分了解黃芩的有效成分及抑菌作用效果，更好地為廣大民眾服務。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試材。黃芩飲片，購自湛江大參林連鎖店；大腸桿菌菌株、金黃色葡萄球菌菌株，嶺南師范學院微生物實驗室保存。

1.1.2儀器。FA2004B電子天平，上海天美天儀器有限公司；GFL-23電熱恒溫鼓風干燥箱，天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；HH.S21-8-S電熱恒溫水浴鍋，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械有限公司；THZ-100恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學儀器有限公司；YRE-5299 旋轉蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責任公司；PHS-3C 精密酸度計，上海天達儀器有限公司；SW-CJ-IBu超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；SPL-250生化培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司。

1.1.3試劑。蛋白胨、牛肉膏、瓊脂，北京奧博星生物技術有限責任公司；石油醚，分析純，廣東光華科技股份有限公司；三氯甲烷，分析純，衡陽市凱信化工試劑有限公司；乙酸乙酯，分析純，天津市光復精細化工研究所；正丁醇，分析純，天津市大茂化學試劑廠；檸檬酸、氫氧化鈉，分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 試驗方法

1.2.1菌液和培養(yǎng)基的制備。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基加熱至全溶，分裝封瓶口后高溫高壓蒸汽滅菌備用。半固體培養(yǎng)基除了瓊脂的量減少50%以外，其余與固體培養(yǎng)基相同。

將各供試菌在其對應的試管斜面培養(yǎng)基上活化，保存在4 ℃冰箱中，用時移種至新鮮瓊脂斜面上，37 ℃溫度培養(yǎng)24 h，用2～3 mL無菌水洗下菌苔。將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的新鮮培養(yǎng)物制成菌液。

1.2.2黃芩水提物的系統(tǒng)分離物的抑菌作用。

1.2.2.1黃芩水提液的制備。取黃芩100 g，加水2 L，浸泡30 min后煎煮，煮沸后文火煎30 min，過濾。藥渣加水1 L，按上述方法進行再次操作后，過濾藥液，合并2次濾液。離心去除掉液體里的藥物殘渣，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至100 mL。置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2.2黃芩水提液中有效成分的分離。采用系統(tǒng)分離法[23]對水提液進行萃取分離。依次用有機溶劑石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取進行萃取，重復3次，所得的萃取液各自合并，再加上萃余項，分別用旋轉蒸發(fā)儀濃縮成濃度為0.5 g/mL。置于0～4 ℃冰箱中備用。

1.2.2.3抑菌作用。每種萃取物各取9支試管，用二倍稀釋法[24]建立濃度梯度。每支試管中有效成分的濃度依次為0.500、0.250、0.125、0.063、0.032、0.016、0.008、0.004、0.002 g/mL。

根據馬永全等[25]的方法。操作前將裝有融化好的半固體培養(yǎng)基的錐形瓶置于55 ℃的恒溫水浴鍋中保溫，加入3 mL菌液混勻；取定量半固體培養(yǎng)基-菌液混合物覆蓋于固體培養(yǎng)基表面，凝固后進行后續(xù)操作。待凝固后將1 mL的移液槍頭倒扣于半固體培養(yǎng)基上進行打孔，每皿4孔，每孔注入0.05 mL黃芩各萃取物，空白對照注入等量對應的萃取劑或無菌水。在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，精確測量抑菌圈直徑。

1.2.3黃芩各萃取物抑菌作用及穩(wěn)定性研究。

1.2.3.1光照對黃芩水提液抑菌能力的影響。根據Wu等[26]的方法，取部分黃芩水提液分成4等份，1份置于超凈工作臺上，打開紫外燈照射2 h；1份置于另一超凈工作臺上，打開白熾燈照射2 h；1份置于晴天太陽光下直射2 h；最后一份用5層報紙包好作對照組，置于工作臺上2 h。用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作指示菌，測量并比較抑菌圈大小。

1.2.3.2pH對黃芩水提液抑菌能力的影響。取部分黃芩水提液分成6等份，用檸檬酸和NaOH溶液調節(jié)黃芩水提液的pH分別為4、5、6、7、8、9，相應pH的無菌水溶液作對照，用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作指示菌，測量并比較抑菌圈大小。

1.2.3.3溫度對黃芩水提液抑菌能力的影響。取部分黃芩水提液分成2等份，分別置于28和4 ℃黑暗條件下儲藏。每隔10 d進行一次抑菌試驗，用大腸桿菌作指示菌，測量并比較抑菌圈大小。

1.3 數據處理與分析采用Excel 2010進行試驗數據的整理、統(tǒng)計與作圖；用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數據統(tǒng)計分析，用單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD法進行多重比較以及差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 黃芩各萃取物的最低抑菌濃度由表1可見，各萃取物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為石油醚0.032 g/mL、氯仿0.063 g/mL、乙酸乙酯0.032 g/mL、正丁醇0.016 g/mL、水0.063 g/mL。由表2可見，各萃取物對大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為石油醚0.032 g/mL、氯仿0.063 g/mL、乙酸乙酯0.032 g/mL、正丁醇0.032 g/mL、水0.125 g/mL。結果顯示正丁醇萃取物對2種菌的抑菌效果最強，其他萃取物均有抑菌效果。黃芩中的主要有效成分為黃芩素、漢黃芩素、漢黃芩苷等苷類化合物，此類化合物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有明顯的抑菌作用。黃芩素等水溶性苷類化合物大量存在于水層中，并被正丁醇萃取。黃芩及其有效成分具有廣譜的抗菌作用?？赡苁歉饔行С煞值臉O性不同而被不同的溶劑萃取，不同的有效成分抗菌效果不同。

表1 黃芩各萃取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑

表2 黃芩各萃取物對大腸桿菌的抑菌圈直徑

2.2 不同萃取物抑菌效果的顯著性分析為了研究不同萃取物對細菌的抑制情況，取濃度為0.500 g/mL的黃芩各萃取液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果進行顯著性分析(P<0.05)，檢驗結果如表3～4所示。

從表3可以看出，黃芩各萃取物中，正丁醇萃取物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強，與石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水萃取物的抑菌效果比較均有顯著差異；氯仿與水萃取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較差；石油醚和乙酸乙酯萃取物的抑菌效果處于正丁醇和氯仿之間，石油醚對金黃色葡萄球菌的抑菌效果比乙酸乙酯的抑菌效果強，且具有顯著差異。

表3 黃芩各萃取物對金黃色葡萄球菌抑菌效果的顯著性分析

從表4可以看出，黃芩各萃取物中，正丁醇萃取物對大腸桿菌的抑菌作用最強，與氯仿和水萃取物的抑菌效果比較均有顯著差異，而與石油醚和乙酸乙酯萃取物的抑菌效果無顯著差異；水萃取物對大腸桿菌的抑菌效果最差，氯仿萃取物對大腸桿菌的抑菌效果比水萃取物的強，與水萃取物的抑菌效果有顯著差異；石油醚和乙酸乙酯萃取物的抑菌效果處于正丁醇和氯仿萃取物之間，石油醚萃取物對大腸桿菌的抑菌效果比乙酸乙酯萃取物的抑菌效果強，但無顯著差異。

從表3和表4可看出，正丁醇萃取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果比其他相萃取物的抑菌效果強且較為明顯，而正丁醇萃取物對大腸桿菌的抑菌效果比氯仿和水萃取物的抑菌效果強且明顯，比石油醚和乙酸乙酯萃取物的抑菌效果強卻不明顯。由此可見，正丁醇對2種菌的抑菌作用均較強，可以從黃芩中提取并制成高效的抑菌類藥物，其中對金黃色葡萄球菌一類的革蘭氏陽性菌抑菌作用較強；而其他萃取物的抑菌作用較差，但也可制成低效的抑菌類藥物進行合理利用，其中石油醚和乙酸乙酯萃取物對大腸桿菌的抑菌作用與正丁醇萃取物的相差不大，可制成對大腸桿菌的高效抑菌類藥物。

表4 黃芩各萃取物對大腸桿菌抑菌效果的顯著性分析

2.3 黃芩水提液抑菌能力的穩(wěn)定性分析

2.3.1光照對黃芩水提液抑菌能力的影響。由圖1可知，太陽光、紫外光和白熾燈光的照射使黃芩水提液的抑菌能力均有所降低，其中白熾燈光的照射對黃芩水提液的抑菌能力幾乎沒有影響，太陽光的照射對黃芩水提液的抑菌能力有一定影響，紫外光次之，但幾種因素之間并沒有顯著差異。

圖1 不同光源的照射對黃芩水提液抑菌能力的影響Fig.1 Effect of irradiation with different light sources on bacteriostatic ability of aqueous extract of Radix Scutellariae

2.3.2pH對黃芩水提液抑菌能力的影響。由圖2可知，當pH≤7時，黃芩水提液的抑菌能力隨著pH的升高而降低。當pH>7時，黃芩水提液抑菌能力急劇下降?？赡苁菈A性條件下黃芩水提液的有效成分如黃芩素等不穩(wěn)定，被氧化而失去抑菌能力的緣故。

圖2 pH對黃芩水提液抑菌能力的影響Fig.2 Effect of pH on the antibacterial ability of aqueous extract of Radix Scutellariae

2.3.3溫度對黃芩水提液抑菌能力的影響。由圖3可知，隨著儲藏時間的延長，黃芩水提液的抑菌能力逐漸減弱。其中28 ℃儲藏下的黃芩水提液的抑菌能力減弱趨勢較為明顯?？赡苁撬嵋褐杏行С煞峙c空氣中的氧氣發(fā)生作用，喪失抑菌能力，有效成分含量減少，使黃芩水提液的總體抑菌能力減弱。28 ℃下儲藏的黃芩水提液中有效成分與氧氣反應的速率較4 ℃的快，有效成分的含量減少速率快，使黃芩水提液的總體抑菌能力減弱得快。但在20 d內，兩者并沒有顯著差異。

圖3 溫度對黃芩水提液抑菌能力的影響Fig.3 Effect of storage at different temperatures on the bacteriostatic ability of aqueous extract of Radix Scutellariae

3 結論

該試驗采用系統(tǒng)分離法對黃芩水提液進行系統(tǒng)分離，獲得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物，并將各萃取物進行抑菌作用比較分析。結果表明，各萃取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑菌作用，抑菌作用從大到小依次為正丁醇>石油醚>乙酸乙酯>氯仿>水。同時，各萃取物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用比大腸桿菌的抑菌作用稍強。

黃芩水提物在不同環(huán)境條件下的抑菌能力試驗結果顯示，黃芩水提物的抑菌能力在強光易減弱，可能是少部分有效成分因降解而失去藥效；黃芩水提物的抑菌能力在堿性條件下易減弱，可能是堿性條件下有效成分不穩(wěn)定，被氧化而失去抑菌能力；黃芩水提物的抑菌能力在室溫環(huán)境下比低溫較易減弱，可能是較高溫度是有效成分的氧化速率加快。因此，在制作和儲藏黃芩水提物類抑菌藥品時，建議在酸性、避光和低溫環(huán)境下進行。