董 娜 ,李文莉 ,張愛菊 ,戴興德* ,張小林

(1.甘肅醫(yī)學(xué)院,平?jīng)?744000;2.甘肅醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,平?jīng)?744000)

過氧化氫酶(CAT)廣泛存在于人體肝臟、腎臟、紅細(xì)胞、肌肉、小腸等組織中,細(xì)胞代謝產(chǎn)生的毒性物質(zhì)H2O2能迅速被CAT 清除[1]。CAT 活性可作為某些慢性疾病預(yù)防診斷的指標(biāo)[2-4],因此CAT活性測定在臨床應(yīng)用中越來越受到人們的重視[5]。文獻(xiàn)報道了多種CAT 活性的測定方法,如滴定法[6]、熒光檢測法[7-8]、紫外分光光度法[9-10]等。近年來,動力學(xué)分光光度法因高靈敏度、低檢出限而備受關(guān)注。文獻(xiàn)[11-13]等采用顯色劑二苯胺磺酸鈉、鄰苯二胺、四甲基聯(lián)苯胺進(jìn)行CAT 活性分析,然而顯色劑溶液保存難度較大,臨床檢驗(yàn)中難以隨用隨配。褪色分光光度法具有穩(wěn)定性高的優(yōu)勢,目前本課題組已完成了羅丹明B[14]、中性紅[15]體系測定CAT 活性的研究,檢出限分別為0.011,0.006 8 U·m L-1。亞甲基藍(lán)(MB)是一種生化染料,光靈敏度高,摩爾吸光系數(shù)大[16]。芬頓試劑(H2O2/Fe2＋)有強(qiáng)氧化性,可氧化MB 使其褪色。鑒于此,本工作基于CAT 對H2O2氧化MB的抑制作用,提出了褪色分光光度法測定人血清中CAT活性的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV1102型紫外-可見分光光度計。

H2O2底液:1 mmol·L-1,用水將0.50 mL 30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)H2O2溶液稀釋至250 mL,以高錳酸鉀法測定其濃度,根據(jù)測定結(jié)果再用水稀釋至1 mmol·L-1。

CAT 標(biāo)準(zhǔn)溶液:1 U·m L-1,將CAT 和水按照1∶10 000質(zhì)量比混勻,以高錳酸鉀法測定其活性,根據(jù)測定結(jié)果再用水稀釋至1 U·m L-1。

CAT、30% H2O2溶液、H2SO4、MB、FeSO4·7 H2O 均為分析純;試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

取人血清樣品10μL于50 mL 容量瓶中,加入1 mmol·L-1H2O2底液3.00 mL,于30 ℃恒溫反應(yīng)15 min,加 入1.00 mol·L-1H2SO4溶 液1.00 mL,充分振蕩混勻后依次加入0.10 mmol·L-1MB溶液5.00 mL 和0.01 mol·L-1FeSO4溶液1.00 mL,室溫反應(yīng)5 min后用水定容至50 mL。以水為參比,測定體系在665 nm 處的吸光度A(1 cm 比色皿),隨同測定CAT 空白體系吸光度A0,以二者差值A(chǔ)-A0(ΔA)計算CAT 活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)原理

試驗(yàn)考察了不同體系在波長400～750 nm 內(nèi)的吸光度A,結(jié)果見圖1。

圖1 紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 UV-Vis absorption spectra

結(jié)果表明:MB體系在665 nm 處可見光區(qū)有強(qiáng)吸收(曲線1),此時摩爾吸光系數(shù)為9.5×104L·mol-1·cm-1;在MB 中加入芬頓試劑時,10 min內(nèi)體系變?yōu)榈{(lán)色,665 nm 處的吸光度A趨近于0(曲線2),說明MB 被氧化褪色;加入CAT 后,MB褪色受限,吸光度A恢復(fù)程度與CAT 活性有關(guān)(曲線3,4)。據(jù)此,可提出基于芬頓試劑-MB 體系的褪色分光光度法測定CAT 活性。

2.2 褪色反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1 催化劑

取1 mmol·L-1H2O2底液3.00 mL,考察了分別以Fe2＋、Fe3＋為催化劑時對MB-H2O2褪色反應(yīng)催化效果的影響,結(jié)果見圖2。

由圖2可知:只加入H2O2,MB褪色不明顯(曲線1,2);加入Fe2＋、Fe3＋對MB-H2O2褪色反應(yīng)均有催化作用,但催化程度有差異;Fe3＋對H2O2氧化MB褪色有微弱促進(jìn)作用(曲線3),Fe2＋對H2O2氧化MB褪色效果更顯著(曲線4),其褪色率是Fe3＋的7.5倍,這是由于Fe2＋可催化H2O2產(chǎn)生氧化性更強(qiáng)的·OH[17]。因此,試驗(yàn)選擇以Fe2＋為MBH2O2褪色反應(yīng)的催化劑。

圖2 催化效果比較Fig.2 Comparison of catalytic effect

2.2.2 MB溶液用量

在不含底液和催化劑的情況下,考察了0.10 mmol·L-1MB 溶液用量對體系吸光度A的影響,結(jié)果見圖3。

圖3 MB溶液用量對體系吸光度的影響Fig.3 Effect of the amount of MB solution on absorbance of the system

由圖3可知:當(dāng)MB 溶液用量為0～7.00 mL時,吸光度A逐漸增大。但為減少測量誤差,吸光度A控制在0.20～0.80內(nèi)為宜。因此,試驗(yàn)選擇的MB溶液用量為5.00 mL,此時體系中MB 濃度為1.00×10-5mol·L-1。

2.2.3 H2SO4溶液用 量

取1 mmol·L-1H2O2底 液3.00 mL,以1.00 mol·L-1H2SO4溶液為反應(yīng)介質(zhì),考察了H2SO4溶液用量對MB 體系和MB＋H2O2＋Fe2＋體系吸光度A的影響,結(jié)果見圖4。

圖4 H2 SO4 溶液用量對體系吸光度的影響Fig.4 Effect of the amount of H2 SO4 solution on absorbance of the system

結(jié)果表明:由于質(zhì)子化效應(yīng),MB體系吸光度A隨酸度增大而減小,但變化幅度不大(曲線1);H2SO4增強(qiáng)了Fe2＋的水溶性和穩(wěn)定性,更有利于MB與H2O2發(fā)生褪色反應(yīng)(曲線2);當(dāng)H2SO4溶液用量為1.00 mL 時,MB褪色明顯,ΔA較大。因此,試驗(yàn)選擇的H2SO4溶液用量為1.00 mL。

2.2.4 FeSO4溶液用量

取1 mmol·L-1H2O2底液3.00 mL,考察了0.01 mol·L-1FeSO4溶液用量分別 為0,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00 mL時 對MB-H2O2褪色反應(yīng)的影響。結(jié)果表明:當(dāng)FeSO4溶液用量小于0.80 mL時,體系吸光度A隨FeSO4溶液用量的增大而減小;當(dāng)FeSO4溶液用量為0.80～3.00 mL 時,吸光度A保持穩(wěn)定;當(dāng)FeSO4溶液用量大于3.00 mL 時,吸光度A隨FeSO4溶液用量的增大而增大,說明過量Fe2＋導(dǎo)致H2O2分解,褪色反應(yīng)不完全。為減少H2O2副反應(yīng),試驗(yàn)選擇的FeSO4溶液用量為1.00 mL。

2.2.5 褪色反應(yīng)時間

在上述優(yōu)化條件下,對MB-H2O2褪色反應(yīng)時間進(jìn)行考察。結(jié)果表明,Fe2＋催化MB-H2O2褪色反應(yīng)速率極快,反應(yīng)5 min時,體系吸光度A達(dá)到最小,并且60 min內(nèi)保持穩(wěn)定。因此,試驗(yàn)選擇的褪色反應(yīng)時間為5 min。

2.3 酶促反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1 H2O2底液用量

在上述優(yōu)化的褪色反應(yīng)條件下,考察了CAT空白體系中1 mmol·L-1H2O2底液用量對體系吸光度A的影響,結(jié)果見圖5。

圖5 H2 O2 底液用量對體系吸光度的影響Fig.5 Effect of the amount of H2 O2 base solution on absorbance of the system

結(jié)果顯示:當(dāng)H2O2底液用量在0～3.00 mL內(nèi)時,體系吸光度A隨H2O2底液用量的增大而減小;當(dāng)H2O2底液用量大于3.00 mL 時,吸光度A保持平穩(wěn)。因此,試驗(yàn)選擇3.00 mL H2O2底液為CAT 酶促反應(yīng)的底物。

2.3.2 酶促反應(yīng)時間

取1 U·m L-1CAT 標(biāo)準(zhǔn)溶液3.00 mL作測試液,其他條件不變,測定不同酶促反應(yīng)時間下體系ΔA,結(jié)果見圖6。

圖6 酶促反應(yīng)時間對體系ΔA 的影響Fig.6 Effect of enzymatic reaction time onΔA of the system

結(jié)果表明:5 min內(nèi)的酶促反應(yīng)表現(xiàn)出一級反應(yīng)特征,ΔA隨反應(yīng)時間的延長而線性增大;10 min后,ΔA保持穩(wěn)定。為使酶促反應(yīng)進(jìn)行完全,試驗(yàn)選擇的酶促反應(yīng)時間為15 min。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

取1 U·m L-1CAT 標(biāo)準(zhǔn)溶 液0,0.50,1.00,0.80,1.50,2.00,2.50,3.00 mL 作測試液,按照試驗(yàn)方法測定體系ΔA,以體系中CAT 活性為橫坐標(biāo),對應(yīng)的體系ΔA為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,CAT 活性在0.01～0.06 U·m L-1范圍內(nèi)與ΔA呈線性關(guān)系,線性回歸方程為ΔA＝12.23E-1.200×10-3,相關(guān)系數(shù)為0.997 6。

按照試驗(yàn)方法平行測定空白體系10次,以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)與線性回歸方程斜率(k)的比值計算檢出限(3s/k),結(jié)果為0.002 4 U·m L-1。

2.5 樣品分析和回收試驗(yàn)結(jié)果

按照試驗(yàn)方法對6 個健康人血清樣品進(jìn)行CAT 活性分析,并對其進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),計算測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和回收率,結(jié)果見表1。對于超出線性范圍的溶液,將其稀釋后再進(jìn)行測定。

由表1可知:兒童和老人血清中CAT活性明顯高于成年人,該結(jié)果與文獻(xiàn)[18]報道一致;測定值的RSD 為1.7%～3.6%,加標(biāo)回收率為92.0%～104%,說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

表1 樣品分析及回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.1 Results of the sample analysis and test for recovery(n＝6)

基于芬頓試劑與MB 快速發(fā)生褪色反應(yīng),利用CAT 對MB＋H2O2＋Fe2＋褪色體系的抑制效應(yīng),從而完成人血清中CAT 活性的測定。該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度,為臨床檢驗(yàn)工作提供診斷依據(jù),也為新型CAT 試劑盒開發(fā)研制提供理論保障。