汪春江, 黃永鵬, 唐 慧, 李昇原,2, 陳 博
(1. 國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102205; 2. 四川輕化工大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院, 四川 宜賓 644000)
奧曲肽(octreotide,OCT)是由8個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀多肽化合物,是首個(gè)人工合成的生長抑素類藥物,對(duì)生長激素、 胰島素等分泌具有選擇性抑制作用[1],目前是治療肢端肥大癥的首選藥物,同時(shí)在治療急慢性胰腺炎、 消化道內(nèi)分泌腫瘤等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2-3]。OCT通常需要長期用藥,主要的制劑形式為靜脈或皮下注射劑,容易對(duì)細(xì)胞組織造成傷害并引發(fā)感染, 因此,對(duì)非侵入性的新型給藥方式及其制劑需求迫切。
干粉吸入劑(dry powder inhalation,DPI)是利用吸入裝置與患者呼吸的氣流相作用,將微粉化藥物遞送至肺部以發(fā)揮局部或全身性治療作用的制劑形式[4-5],具有方便攜帶、 操作簡單、 劑量準(zhǔn)確、 穩(wěn)定性好、 患者依從性高等優(yōu)點(diǎn),且肺泡和毛細(xì)管區(qū)域吸收面積大, 血流豐富, 交換距離短, 酶降解作用弱,特別適用于OCT等多肽藥物[6-7]。本課題組研究證明,以微粉形式吸入OCT能夠?qū)崿F(xiàn)與短效皮下注射幾乎相同的生物利用度[8]。藥物遞送和釋放是DPI研究的核心問題,一般要求微粉制劑的空氣動(dòng)力學(xué)粒徑小于5 μm且具有良好的流動(dòng)性。由于多肽藥物普遍半衰期較短,因此藥物釋放上要求制劑能夠有效延長藥物作用時(shí)間, 降低給藥頻率, 減弱毒副作用[9-10]。
介孔二氧化硅(mesoporous silica, MS)具有生物相容性好、 微觀形貌多樣且可控、 比表面積與比孔容大、 空氣動(dòng)力學(xué)性能優(yōu)越、 裝載藥物結(jié)合力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[11-14], 理論上是用于DPI的理想載體材料, 兼具優(yōu)異的遞送和釋放性能, 但目前尚未發(fā)現(xiàn)MS材料負(fù)載多肽藥物發(fā)揮吸入并延長藥物作用時(shí)間的文獻(xiàn)報(bào)道。
本文中擬采用溶膠-凝膠工藝制備4種不同的MS材料,通過浸漬吸附-冷凍干燥工藝負(fù)載模型藥物OCT構(gòu)建可吸入微粉制劑,并對(duì)載體及微粉制劑開展微觀形貌、 物相結(jié)構(gòu)、 粒度分布、 載藥量、 體外釋放性能以及體外吸入沉積等性能評(píng)價(jià),為設(shè)計(jì)OCT及其他多肽藥物的干粉吸入制劑提供研究基礎(chǔ)。
實(shí)驗(yàn)材料有奧曲肽, 純度99.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)), 浙江湃肽生物有限公司生產(chǎn)(批號(hào)為2018053003-1); 吸入α-乳糖(粒徑為74 μm)、 氯化鈉、 硅酸鈉(模數(shù)為3.5)、 十二烷基苯磺酸鈉(sodium dodecyl benzene sulfonate, SDBS), 均為分析純, 北京化工廠生產(chǎn); 乙二酸、 正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate, TEOS),均為分析純,美國默克公司生產(chǎn);乙醇、 正己烷、 乙腈、 高氯酸、 硫酸、 鹽酸均為分析純,氨水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%,北京試劑廠生產(chǎn);超純水,實(shí)驗(yàn)室自制。
主要儀器設(shè)備有LGJ-18S型真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)、 3H-2000PS2型比表面積及孔徑分析儀(貝士德儀器科技(北京)有限公司)、 ZS90型納米粒度電位儀(英國馬爾文儀器有限公司)、 SU8020型掃描電子顯微鏡(日本日立公司)、 Tecnai G2型場發(fā)射透射電子顯微鏡(美國FEI公司)、 D8-ADVANCE型X射線衍射儀(德國布魯克公司)、 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)以及JMT-3型安德森級(jí)聯(lián)撞擊器(北京明杰藍(lán)天科技有限公司)。
采用溶膠-凝膠工藝,通過改變反應(yīng)條件,分別制備粒徑為厘米級(jí)、 微米級(jí)和納米級(jí)的MS氣凝膠顆粒材料,具體方法如下所示。
塊狀氣凝膠(MS1):按照物質(zhì)的量比為1∶4∶5∶0.2的比例混合TEOS、 乙醇、 乙二酸和氨水溶液,在溫度為30 ℃條件下水浴攪拌12 h;攪拌結(jié)束后逐滴滴加氨水,待溶液中形成凝膠后的36 h內(nèi)用乙醇交換凝膠中的水,重復(fù)3次;再用正己烷交換凝膠中的乙醇,重復(fù)3次后干燥至恒重。
微米級(jí)氣凝膠(MS2):將37.5 mL TEOS、 250 mL乙醇與100 mL超純水混合均勻后用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2~3;攪拌2 h后用濃氨水調(diào)節(jié)混合溶液的pH至9~10;取10 mL溶液靜置,在形成透明凝膠后,加入10 mL TEOS和90 mL乙醇的混合溶液,反應(yīng)48 h;將溶液預(yù)凍后,真空冷凍干燥。
納米級(jí)微球氣凝膠(MS3):將40 mL濃氨水和400 mL乙醇混合均勻后水浴加熱至溫度為35~40 ℃;將20 mL TEOS和200 mL乙醇混合均勻,取3/4的TEOS乙醇溶液滴加至氨水-乙醇混合溶液,劇烈攪拌30 min;滴加余下1/4的TEOS溶液,在溫度為60 ℃條件下反應(yīng)2 h;待體系冷卻至室溫后,靜置陳化3 h后過濾洗滌干燥至恒重。
納米級(jí)顆粒氣凝膠(MS4):將100 mL硅酸鈉溶液(摩爾濃度為0.4 mol/L)加熱至溫度為70 ℃后加入5 mL氯化鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%)和0.4 g SDBS;在攪拌下滴加稀硫酸至溶液出現(xiàn)大量絮狀沉淀;在溫度為70 ℃條件下靜置陳化0.5 h后過濾洗滌干燥至恒重。
將制備的MS載體材料置入溫度為120 ℃烘箱活化2 h; 配制質(zhì)量濃度為50 g/L的OCT水溶液, 按照載體與OCT的質(zhì)量比為1∶2的條件向溶液中加入載體, 在轉(zhuǎn)速為1 000 r/min的條件下持續(xù)吸附24 h; 過濾OCT溶液與MS的混合物, 分離固體進(jìn)行冷凍干燥。
1.4.1 OCT定量分析
采用高效液相色譜法對(duì)OCT進(jìn)行定量分析,具體實(shí)驗(yàn)條件如下:色譜柱(安捷倫Eclipse plus C18)的尺寸為φ4.6 mm×250 mm (直徑×長度)、色譜柱內(nèi)填料間的孔徑為5 μm,流動(dòng)相為乙腈與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的高氯酸水溶液的混合液(體積比為30∶70),進(jìn)樣量為5 μL,流速為1.0 mL/min,檢測波長為210 nm;柱溫為25 ℃[15]。
1.4.2 理化性能
采用X射線衍射儀對(duì)載體進(jìn)行物相結(jié)構(gòu)表征,操作電壓為40 kV,操作電流為40 mA,Cu靶,波長為1.540 6 ?,掃描區(qū)域?yàn)?0°~90°,掃描速率為6(°)/min。
采用掃描電子顯微鏡和場發(fā)射透射電子顯微鏡表征載體和制劑的微觀形貌,掃描電鏡操作電壓為3~5 kV,放大倍數(shù)為200~25 000;透射電鏡操作電壓為200~300 kV,放大倍數(shù)為1 000~150 000。
采用比表面積及孔徑分析儀測定載體的比表面積與孔徑,操作過程中選擇氮?dú)庾鳛槲劫|(zhì),設(shè)定脫氣溫度為300 ℃,脫氣時(shí)間為2 h。
采用納米粒度電位儀測量Zeta電勢,選擇水為分散介質(zhì)。
1.4.3 載藥量分析
精密稱取適量的微粉制劑置于燒杯中, 加入適量的超純水; 以500 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌6 h, 超聲20 min, 將藥物充分溶解; 吸取清液過濾后,采用高效液相色譜法進(jìn)行定量分析,根據(jù)質(zhì)量換算得出載藥量(微粉制劑中OCT的質(zhì)量分?jǐn)?shù),w)。
1.4.4 體外釋放性能
參照文獻(xiàn)[16], 以溫度為(37±0.5) ℃的水作為溶出介質(zhì), 取適量微粉制劑裝進(jìn)透析袋中, 注水至充盈以保證微粉制劑能夠完全潤濕; 兩端扎緊后浸沒于100 mL水中, 在溫度為37 ℃、 轉(zhuǎn)速為100 r/min條件下攪拌, 分別在攪拌1、 5、 10、 30、 60、 120、 240、 360、 720、 1 440 min時(shí)對(duì)溶出介質(zhì)進(jìn)行采樣并補(bǔ)充置換同體積、 同溫度的水;通過高效液相色譜法對(duì)樣品進(jìn)行定量分析,藥物累計(jì)溶出度Q的計(jì)算公式為
(1)
式中:Ci、Cn分別為第i次和第n次取樣時(shí)的質(zhì)量濃度,i=1,2,…,n, g/L;m為微粉制劑的質(zhì)量, mg;w為載藥量,%;V1為各時(shí)刻的取樣體積, mL;V2為溶出介質(zhì)的體積,mL。
1.4.5 體外吸入性能
參照文獻(xiàn)[16],采用安德森級(jí)聯(lián)撞擊器(ACI)測定微粉制劑的排空率Ed和有效部位沉積率FP,安德森級(jí)聯(lián)撞擊器示意圖如圖1所示。Ed和FP是指在氣流作用下,微粉從吸入裝置和膠囊中排出以及在肺部有效部位實(shí)現(xiàn)沉積的能力,是評(píng)價(jià)微粉制劑體外吸入性能的關(guān)鍵指標(biāo)。ACI的第0—8級(jí)分離層模擬人體的下呼吸道,當(dāng)氣流流速為28.3 L/min時(shí),第0—8級(jí)分離層的空氣動(dòng)力學(xué)截止直徑分別為9.0、 5.8、 4.7、 3.3、 2.1、 1.1、 0.70、 0.43、 0.22 μm。ACI的第9級(jí)為預(yù)分離器,第10級(jí)為連接吸入裝置和ACI的L型管,第11級(jí)為吸入裝置。
圖1 安德森級(jí)聯(lián)撞擊器示意圖Fig.1 Schematic of anderson cascade impactor
將微粉制劑根據(jù)載藥量混入適量的乳糖,混合均勻后將樣品裝載于膠囊中;稱取10粒膠囊置于吸入器后連接ACI;刺破膠囊后以28.3 L/min的氣流流速抽吸8 s,間隔1 s后復(fù)吸8 s,重復(fù)3次后停止;用純水溶解回收留在各級(jí)的微粉制劑,定容后通過HPLC進(jìn)行定量分析。計(jì)算公式為
(2)
(3)
(4)
式中:R為藥物回收率,%;Vi為ACI中第i(i=0, 1, …, 11)級(jí)OCT的體積, mL。 當(dāng)R值為95%~105%時(shí), 通過式(3)、 (4)分別計(jì)算Ed和Fp。
4種介孔二氧化硅載體的的XRD圖譜和SEM圖像如圖2、 3所示, 物理性能如表1所示。 結(jié)果表明: 4種孔二氧化硅載體材料的XRD圖譜中均無晶體衍射峰, 且在2θ約為22 °處出現(xiàn)1個(gè)強(qiáng)峰, 說明是具有無定形結(jié)構(gòu)的二氧化硅。 MS1為平均粒徑為1.8 cm的淡藍(lán)色塊狀固體, MS1由25 nm的單元顆粒組成, 單元顆粒間平整地聚集連接但中間存在縫隙, 這樣的結(jié)構(gòu)讓MS1雖然具有較大的粒徑, 但仍具有較大的比表面積和和比孔容; MS2是白色粉末狀固體, 由具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的、 平均粒徑為34 μm的無規(guī)則小塊組成, 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)讓MS2具有在4種材料中最大的比表面積和比孔容; MS3是由粒徑約為100 nm的微球組成的白色粉末狀固體, 微球表面粗糙, 微球中存在明顯的孔道結(jié)構(gòu); MS4則是由粒徑為34 nm的小顆粒組成的白色粉末狀固體, 小顆粒相互連接聚集, MS4無明顯孔道結(jié)構(gòu); 孔道結(jié)構(gòu)使得MS3比MS4具有了更大的比表面積和比孔容。
圖2 4種介孔二氧化硅載體的XRD圖譜Fig 2 XRD patterns of four kinds of mesoporous silica carriers
(a)MS1的宏觀形貌(b)MS1(放大100 000倍)(c)MS2(放大200倍)(d)MS2(放大100 000倍)(e)MS3(放大100 000倍)(f)MS3(放大100 000倍)(g)MS4(放大100 000倍)(h)MS4(放大100 000倍)圖3 4種介孔二氧化硅載體的SEM圖像Fig.3 SEM images of four kinds of mesoporous silica carriers
表1 4種介孔二氧化硅載體的物理性能
負(fù)載藥物的過程中,淡藍(lán)色的大塊材料MS1在OCT溶液中逐漸溶蝕分散,形成乳白色懸浮液;MS2在吸附過程剛開始時(shí),漂浮在溶液表面,但隨著攪拌時(shí)間的增加逐漸分散于溶液中;MS3和MS4在OCT溶液中分散速度較快且分散良好。將MS1、 MS2、 MS3、 MS4材料制備的微粉制劑分別記為P1、 P2、 P3、 P4,冷凍干燥后得到的所有微粉制劑均為白色粉末。4種微粉制劑的微觀形貌如圖4所示。由圖可見,MS1載藥后原有的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,單元顆粒無規(guī)則地聚集在一起,顆粒之間仍存在空隙;MS2載藥后,原有的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被填充,并部分形成了片狀結(jié)構(gòu);MS3與MS4載藥前后變化不大,MS3載藥后仍然保持了原有的規(guī)則形貌,MS4載藥后的空隙部分明顯減少,小顆粒間存在團(tuán)聚現(xiàn)象。
(a) P1(b)P2(c)P3(d)P4圖4 4種微粉制劑的SEM圖像Fig.4 SEM images of four kinds of micropowder pharmacies
4種微粉制劑的載藥量如圖5所示。由圖可見,制劑P1、 P2和P4的載藥量均大于30%,其中比孔容最大且Zeta電勢為負(fù)值的載體材料MS2制備的微粉制劑P2的載藥量最高,達(dá)到了36%;制劑P3的載藥量最低為13%,可能是由于載體材料MS3的Zeta電勢為正值,與OCT產(chǎn)生電荷排斥作用而導(dǎo)致載藥量偏低。4種載體均實(shí)現(xiàn)了對(duì)藥物的有效裝載,這是因?yàn)?,OCT水溶液的Zeta電勢為正值,Zeta電勢為負(fù)值的載體材料容易通過電荷的相互作用而吸引在一起;除載體材料的孔道以外,材料的顆粒與顆粒之間形成的縫隙以及材料顆粒的表面也容易發(fā)生吸附;載體材料在孔道裝載、表面吸附和靜電作用的共同影響下完成對(duì)藥物的裝載。
圖5 4種微粉制劑的載藥量Fig.5 Drug loading of fourkinds of micropowder pharmacies
微粉制劑的溶出度隨反應(yīng)時(shí)間的變化體現(xiàn)了微粉制劑的體外釋放性能。 4種微粉制劑的溶出度隨反應(yīng)時(shí)間的變化規(guī)律如圖6所示。 由圖可見, 反應(yīng)時(shí)間為0~10 min時(shí), 載藥量高的3種微粉制劑P1、 P2和P4在溶出過程初期的溶出度高于純OCT, 說明被吸附在載體顆粒間的縫隙和載體顆粒表面的OCT在溶出介質(zhì)中迅速溶出后, 載體孔道內(nèi)的OCT可持續(xù)緩慢溶出; 反應(yīng)時(shí)間為0~1 440 min時(shí), 制劑P1的溶出曲線與純OCT的基本一致, 未能延長溶出時(shí)間, 制劑P2、 P3和P4延長了溶出時(shí)間, 4種材料中粒徑最小、 平均孔徑最大的載體MS4載藥后得到的制劑P4延長藥物作用時(shí)間的效果最好; 微粉制劑P3的溶出度始終低于純OCT的,且持續(xù)釋藥時(shí)間達(dá)24 h, 有效延長了藥物作用的時(shí)間。
(a)0~10 min(b)0~1 440 min圖6 4種微粉制劑的溶出度隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.6 Variation of dissolution of four kinds of micropowder pharmachies with reaction time
微粉制劑的體外吸入性能由有效部位沉積率Fp和排空率Ed來體現(xiàn)。4種微粉制劑的有效部位沉積率和排空率如表2所示。由表可知,4種微粉制劑均有較好的Ed,達(dá)到了99%以上。制劑P4的顆粒之間存在團(tuán)聚導(dǎo)致Fp最低,超過一半的顆粒被截留在了預(yù)分離器中,無法實(shí)現(xiàn)有效部位的沉積;制劑P1、 P2和P3的Fp均超過了50%,其中制劑P1的顆粒偏大,仍有小部分單元顆粒留在了預(yù)分離器;制劑P2具有片狀結(jié)構(gòu),在氣流下更容易分散,因此具有最高的Fp; 制劑P3保持了載體原有的規(guī)則形貌,F(xiàn)p大于60%, 均勻分布在ACI的0—7級(jí)且沒有被預(yù)分離器截留,有利于藥物的傳遞。
表2 微粉制劑的有效部位沉積率和排空率
本文中制備了4種MS載體材料之后,通過浸漬吸附-冷凍干燥工藝負(fù)載藥物奧曲肽構(gòu)建了4種微粉制劑,并對(duì)MS載體材料以及微粉制劑進(jìn)行了理化、 釋放以及吸入等性能的研究。
1)4種MS載體材料完成了預(yù)期設(shè)計(jì),具有不同的形貌、 粒徑、 比孔容、 比表面積等性能,能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)藥物OCT的有效負(fù)載。
2)4種微粉制劑中P2的載藥量最高,達(dá)到了36%; P3的載藥量最低,達(dá)到了13%; P1、 P2、 P4未能保持載體的形貌;P2、 P3和P4延長了溶出時(shí)間; P2、 P3具有較高的有效部位沉積率,能夠滿足肺部吸入的遞送要求,并能夠延長藥物作用的時(shí)間。
3)單分散介孔二氧化硅微球-OCT微粉制劑(P3)具有最佳的綜合性能,排空率達(dá)到了100%,有效部位沉積率大于60%,具有良好的吸入性能;在溶出過程中的溶出速率始終低于純OCT的且持續(xù)釋藥時(shí)間達(dá)到24 h,有效延長了藥物的作用時(shí)間;保持了載體MS3原有的粒徑均一的單分散球形形貌,有利于提高藥物轉(zhuǎn)運(yùn)傳遞劑量的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性。