安飛飛 齊劍雄 陳松筆 羅秀芹 蔡杰 薛晶晶

摘??要：查爾酮合酶（chalcone?synthase，?CHS）是類黃酮合成途徑的第一個(gè)限速酶，在植物花色形成、生長發(fā)育以及非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用。為明確木薯MeCHS基因家族的特性及在木薯塊根采后腐爛（PPD）中的表達(dá)，本研究利用生物信息學(xué)方法對木薯MeCHS基因家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等分析。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測MeCHS基因在不同品種、不同組織及塊根PPD過程中的表達(dá)情況，同時(shí)克隆并構(gòu)建3個(gè)高表達(dá)的MeCHS基因的亞細(xì)胞定位載體并進(jìn)行煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化以確定其定位。在木薯基因組中共鑒定出5個(gè)MeCHS基因家族成員，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)：MeCHS基因表達(dá)具有明顯的組織特異性，在莖中表達(dá)水平最高；在木薯中主要表達(dá)的MeCHS基因?yàn)镸eCHS1、MeCHS2和MeCHS3，且3個(gè)基因隨著SC8塊根貯藏時(shí)間的延長表達(dá)量逐步升高。將成功克隆得到的MeCHS1、MeCHS2和MeCHS3基因經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草下表皮細(xì)胞，顯微觀察表明3個(gè)基因均定位于細(xì)胞質(zhì)，與預(yù)測結(jié)果相符。該研究結(jié)果可為進(jìn)一步揭示木薯MeCHS基因家族的功能與提高木薯塊根耐PPD能力提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：木薯；查爾酮合酶；qRT-PCR；克隆；表達(dá)分析中圖分類號：S533；S435.33??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Characteristics?and?Expression?Analysis?Of?Chalcone?Synthase?MeCHS?Family?in?Cassava

AN?Feifei1，2，?QI?Jianxiong1，?CHEN?Songbi2，?LUO?Xiuqin1，?CAI?Jie2，?XUE?Jingjing2*

1.?Tropical?Crops?Genetic?Resources?Institute，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences?/?Key?Laboratory?of?Conservation?and?Utilization?of?Cassava?Germplasm?Resources，?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs，?Haikou，?Hainan?571101，?China;?2.?Sanya?Research?Institute，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences，?Sanya，?Hainan?572025，?China

Abstract：?Chalcone?synthase?（CHS）?is?the?first?limiting?enzyme?in?flavonoid?synthesis?pathway?and?plays?an?important?role?in?flower?color?formation，?growth?and?development，?and?abiotic?stress.?In?order?to?clarify?the?characteristics?of?cassava?MeCHS?gene?family?and?its?expression?in?cassava?postharvest?physiological?deterioration?（PPD），?the?MeCHS?gene?family?was?analyzed?using?bioinformatics，?including?physicochemical?property?and?subcellular?location.?qRT-PCR?was?carried?out?to?detect?the?expression?levels?of?MeCHS?genes?in?different?varieties，?different?tissues?and?PPD?process.?The?genes?with?significant?relative?expression?were?selected?for?cloning?and?subcellular?localization?verification.?A?total?of?5?MeCHS?gene?members?were?identified?in?the?cassava?genome.?The?secondary?structure?analysis?showed?that?the?MeCHS?gene?family?was?mainly?composed?of?α-helices?and?random?coils.?Tissue?specific?expression?indicated?that?the?expression?levels?of?MeCHS?genes?were?higher?in?stems.?The?major?expressed?MeCHS?genes?in?cassava?were?MeCHS1，?MeCHS2?and?MeCHS3;?and?the?expression?levels?of?these?three?genes?were?gradually?increase?with?PPD.?MeCHS1，?MeCHS2?and?MeCHS3?were?successfully?cloned;?and?fluorescence?transient?expression?showed?that?MeCHS1，?MeCHS2?and?MeCHS3?were?localized?in?the?cytoplasm，?which?was?consistent?with?the?predicted?results.?This?study?will?provide?a?theoretical?basis?for?further?revealing?the?function?of?MeCHS?gene?family?and?improving?the?PPD?tolerance?of?cassava.

Keywords：?cassava;?chalcone?synthase;?qRT-PCR;?cloning;?expression?analysis

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2023.12.003

類黃酮是植物體內(nèi)廣泛存在的一類重要的次生代謝物，主要包括花青素、異黃酮、黃酮醇等。查爾酮合酶（CHS）是催化類黃酮生物合成的第一個(gè)限速酶，催化4-香豆酰輔酶A與丙酚CoA生成4，5，7-三羥基黃烷酮，產(chǎn)生各種黃酮類化合物，也可在查爾酮異構(gòu)酶的催化下衍生成各類黃酮化合物[1]。目前CHS基因在擬南芥、水稻、甜橙、鐵皮石斛、蘋果、虎杖等物種中得到鑒定和克隆[2-7]。CHS基因也參與植物對非生物脅迫的響應(yīng)，對花色形成、生長發(fā)育、激素調(diào)節(jié)都會產(chǎn)生影響[8]。研究發(fā)現(xiàn)CHS基因的表達(dá)受茉莉酸甲酯、脫落酸、水楊酸的誘導(dǎo)[9-11]，同時(shí)過表達(dá)該類基因可提高植物的耐鹽及耐旱性[12-13]。

木薯（Manihot?esculenta?Crantz）是世界亞熱帶和熱帶地區(qū)近10億人的主要糧食作物，在我國“一帶一路”倡議中發(fā)揮積極作用[14]。木薯塊根在收獲后1～3?d就開始發(fā)生腐爛，稱為“采后生理腐爛”（postharvest?physiological?deterioration，?PPD）[15]。木薯PPD是由塊根收獲時(shí)的機(jī)械傷害引起的一系列生理生化反應(yīng)，屬于植物非生物脅迫的一種。傷害可誘導(dǎo)類黃酮化合物積累[16-17]，表兒茶素可以作為PPD的標(biāo)記代謝物[18]，柚皮苷和山奈酚可抑制PPD過程中超氧化物歧化酶（SOD）活性[19]，但具體的作用機(jī)制尚未明晰。推測塊根類黃酮代謝物積累抑制了機(jī)械傷害帶來的活性氧（ROS）爆發(fā)，進(jìn)而延緩塊根PPD發(fā)生。CHS作為類黃酮生物合成的第一個(gè)限速酶，了解其結(jié)構(gòu)特征及其表達(dá)特性對探索類黃酮生物合成以及木薯塊根發(fā)生腐爛的遺傳調(diào)控至關(guān)重要。目前，木薯CHS基因家族尚未報(bào)道，且其在木薯塊根PPD調(diào)控中的機(jī)制研究甚少，前期研究發(fā)現(xiàn)抑制木薯MeCHS3的表達(dá)，其塊根PPD程度顯著加快[17]。因此，本研究利用木薯和擬南芥植物基因組數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)方法篩選和鑒定木薯CHS基因家族成員，并對木薯CHS基因家族各成員的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位等進(jìn)行分析，初步揭示其在不同品種、不同組織及塊根PPD中的表達(dá)模式，同時(shí)鑒定MeCHS1～MeCHS3的亞細(xì)胞定位，為進(jìn)一步揭示木薯CHS基因家族功能和提高木薯塊根的耐PPD能力奠定理論基礎(chǔ)。

1??材料與方法

1.1??材料

本研究所選用的木薯材料為木薯品種SC5、SC8、SC9、SC14、SC102和SC6068，采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國家木薯種質(zhì)資源圃?；ā⑷~片、葉柄、腋芽、莖、須根、脆性胚性愈傷組織（FEC）、塊根等不同組織均來自于SC8。SC8于2022年3月種植于國家木薯種質(zhì)資源圃（儋州），植后10個(gè)月的木薯塊根用于PPD觀察。用于亞細(xì)胞定位的本生煙由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2??方法

1.2.1??MeCHS基因家族的序列獲得和比對??從擬南芥基因組網(wǎng)站TAIR（https：//www.Arabidopsis.?org/）下載CHS基因的編碼序列，導(dǎo)入木薯基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST搜索，下載木薯CHS基因全長、CDS和蛋白序列。同時(shí)使用DNAMAN軟件對木薯CHS基因家族成員的氨基酸序列進(jìn)行多重比對，利用HMMER在線軟件（https：//www.?ebi.ac.?uk/Tools/hmmer/）對木薯CHS基因家族成員進(jìn)行結(jié)構(gòu)域篩選，剔除不含特定結(jié)構(gòu)域的基因。

1.2.2??MeCHS基因家族理化性質(zhì)分析??利用ExPASy在線軟件（https：//web.expasy.org/prot param/）分析MeCHS基因的理化性質(zhì)。運(yùn)用Cell-?PLoc?2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-?PLoc-2/）和Prabi（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線軟件分別預(yù)測MeCHS基因家族成員的亞細(xì)胞定位和α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、不規(guī)則卷曲等二級結(jié)構(gòu)。利用SingalP（https：//services.healthtech.dtu.dk/servi ces/SignalP-5.0/）在線軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測。

1.2.3??MeCHSs在不同組織、不同品種及PPD中的表達(dá)分析??參照RNAprep?Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441，天根）提取SC8不同組織[花、幼葉、嫩葉、老葉、葉柄、腋芽、莖、須根、FEC、貯藏根（4個(gè)月、7個(gè)月、10個(gè)月）]、不同品種葉片（SC5、SC8、SC9、SC14、SC102、SC6068）以及SC8采后貯藏過程中的塊根（0、1、3、5、7?d）總RNA。cDNA第一鏈的合成參照Thermo?Scientific?RevertAid?RT試劑盒（K1691，賽默飛）說明書進(jìn)行。設(shè)計(jì)MeCHSs的qRT-PCR特異引物（表1），以MeActin基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，使用2–ΔΔCT法計(jì)算MeCHSs的相對表達(dá)情況。

1.2.4??木薯MeCHS亞細(xì)胞定位??設(shè)計(jì)MeCHS1、MeCHS2和MeCHS3的全長擴(kuò)增引物（表1），以SC8葉片cDNA為模板，擴(kuò)增MeCHS片段，經(jīng)回收后，采用Nimble?Cloning試劑盒將片段與pNC-Green-SubN空載體連接，具體操作過程參照YAN等[20]的方法。經(jīng)過轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞、PCR篩選陽性單克隆，測序驗(yàn)證正確后的載體即為亞細(xì)胞定位所需的重組載體，測序引物如表1所示。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草，3?d后使用激光共聚焦顯微鏡觀察MeCHS的定位情況，具體操作過程參照AN等[21]的方法。

1.3??數(shù)據(jù)處理

采用Excel?2013和DPS?v7.05統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)采用新復(fù)極差法（Duncan）。

2??結(jié)果與分析

2.1??MeCHS基因家族成員理化性質(zhì)分析

從木薯基因組中共鑒定到5個(gè)CHS家族基因，分別命名為MeCHS1～MeCHS5。通過氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，MeCHS蛋白序列相似性為48.60%，5個(gè)MeCHS均含CHS基因家族的4個(gè)保守活性位點(diǎn)氨基酸殘基（箭頭位置），4個(gè)MeCHS均含CHS基因家族特征氨基酸序列WGVLFGFGPGLT（黑色方框），而MeCHS5特征氨基酸序列為LGILFGCGPGLT（圖1）。由表2可知，5個(gè)MeCHS蛋白的編碼氨基酸數(shù)目基本相同，在390個(gè)左右；分子質(zhì)量均在43.00?kDa左右，理論等電點(diǎn)在6.03～6.34之間。在5個(gè)MeCHS蛋白中，MeCHS4蛋白和MeCHS5蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)均大于40.0，屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.2??MeCHS蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析及亞細(xì)胞定位預(yù)測

利用Prabi工具進(jìn)行MeCHS蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如表3所示。5個(gè)MeCHS蛋白均以α-螺旋（占比43.48%～48.34%）和不規(guī)則卷曲（占比32.22%～35.19%）為主，其次有延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角，且各類二級結(jié)構(gòu)所占比例相近，說明木薯MeCHS蛋白家族的5個(gè)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)非常相似。利用SingalP?5.0軟件在線分析表明，5個(gè)MeCHS蛋白均沒有信號肽。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，5個(gè)MeCHS蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（表3）。

2.3??MeCHS基因家族表達(dá)分析

2.3.1??不同木薯品種中MeCHSs基因的表達(dá)分析??MeCHS基因在不同木薯品種（SC5、SC8、SC9、SC14、SC102、SC6068）葉片中的表達(dá)如圖2所示。結(jié)果顯示，以SC5葉片為對照，MeCHS2和MeCHS3在SC8的葉片中表達(dá)最高，MeCHS1和MeCHS4在SC14的葉片中表達(dá)最高，MeCHS5在不同品種的葉片中幾乎均不表達(dá)。結(jié)果表明MeCHS基因的表達(dá)具有明顯的品種差異性。

2.3.2??MeCHSs在葉片、莖等不同組織中的表達(dá)分析??利用木薯品種SC8不同組織（葉片、葉柄、腋芽、莖、花、FEC、須根、塊根）的cDNA進(jìn)行MeCHS基因表達(dá)檢測。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，以SC8葉片為對照，MeCHS1、MeCHS2和MeCHS3在木薯莖中表達(dá)量最高，腋芽和花次之，在葉柄、須根和塊根表達(dá)量較低，具有明顯的組織特異性。MeCHS4和MeCHS5在SC8各個(gè)組織中表達(dá)量均不高（圖3）。

2.3.3??MeCHSs在木薯塊根采后腐爛過程中的表達(dá)分析??在SC8塊根采后不同時(shí)間（0、1、3、5、7?d）對MeCHS基因家族成員進(jìn)行qRT-PCR分析（圖4）。MeCHS1、MeCHS2和MeCHS3隨著SC8塊根貯藏時(shí)間的延長表達(dá)量逐步升高，其中MeCHS2上升幅度最大，MeCHS4和MeCHS5在SC8木薯塊根貯藏過程中幾乎無變化，推測MeCHS1、MeCHS2和MeCHS3參與塊根PPD調(diào)控過程。

2.4??MeCHSs克隆及亞細(xì)胞定位

根據(jù)已經(jīng)獲得的MeCHS1～MeCHS3基因的CDS區(qū)在線設(shè)計(jì)基因特異性引物，以SC8塊根cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到1200?bp大小的特異條帶（圖5），經(jīng)比對，克隆獲得的MeCHS2和MeCHS3基因的CDS序列與Phytozome木薯基因組公布數(shù)據(jù)一致，而MeCHS1基因的CDS序列與數(shù)據(jù)庫存在4個(gè)堿基變化，但是不影響編碼的蛋白質(zhì)序列，這可能是由于不同木薯品種導(dǎo)致的堿基差異。

為進(jìn)一步確認(rèn)MeCHS1～MeCHS3蛋白的亞細(xì)胞定位，將攜帶35S：：GFP：：MeCHS1～MeCHS3質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注射煙草葉片下表皮，3?d后取注射部位周邊直徑1?cm范圍內(nèi)的葉片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察葉片下表皮細(xì)胞中綠色熒光蛋白的定位，結(jié)果如圖6所示。綠色熒光信號表明35S：：GFP：：MeCHS1～MeCHS3融合蛋白均集中在細(xì)胞質(zhì)中，該結(jié)果與亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果一致。

3??討論

CHS是植物類黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶，也是與苯丙酮代謝有關(guān)的酶。到目前為止，已從白木香[22]、矮牽牛[23]等物種中分離鑒定出CHS基因，其中雙子葉植物中的CHS基因家族數(shù)目較多，如辣椒中有7個(gè)CHS基因[24]，番茄中有8個(gè)CHS基因[25]，而在木薯中鑒定出5個(gè)MeCHS基因。由此可見，不同物種中CHS基因在數(shù)量上存在差異，這可能與不同物種基因組大小及物種進(jìn)化有關(guān)。通過生物信息學(xué)對MeCHS蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)MeCHS1、MeCHS2和MeCHS3蛋白的理化性質(zhì)并無太大差別，而MeCHS4、MeCHS5蛋白在蛋白穩(wěn)定性上差別較大，屬于不穩(wěn)定蛋白，這可能是MeCHS4與MeCHS5基因在SC8木薯各組織及塊根PPD過程中不表達(dá)的原因。

對木薯CHS基因家族進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，MeCHS蛋白二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主，β-轉(zhuǎn)角則相對較少，這一結(jié)果與葡萄CHS蛋白的研究結(jié)果一致[26]。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，木薯CHS蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化顯示MeCHS1、MeCHS2和MeCHS定位于細(xì)胞質(zhì)中，與預(yù)測結(jié)果相符，這與紅仁核桃中JrCHS蛋白質(zhì)的定位結(jié)果一致[27]。章妮等[28]研究發(fā)現(xiàn)毛竹CHS蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，少數(shù)定位于細(xì)胞質(zhì)。木薯CHS基因可能大多在細(xì)胞質(zhì)中起作用，但是不同物種中CHS基因家族成員在細(xì)胞器中的分布也存在一定差異。

CHS基因的表達(dá)與器官形態(tài)建成、功能分化有著密切關(guān)系，由于表達(dá)模式的差異，使其表達(dá)具有組織特異性[26]。研究表明人參CHS基因主要在葉片中表達(dá)[9]，杧果CHS1基因的相對表達(dá)量在葉和花中較高[29]，葡萄CHS基因主要在根中表達(dá)[26]。利用qRT-PCR技術(shù)研究MeCHS基因在木薯不同品種以及不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在木薯中表達(dá)的MeCHS基因主要為MeCHS1、MeCHS2和MeCHS3，且木薯CHS基因在莖中表達(dá)最高，該基因家族中MeCHS4和MeCHS5在各組織中的表達(dá)水平均較低。MeCHSs在不同品種中的表達(dá)也不盡相同，在SC8葉片中的表達(dá)最高。這與前人的研究結(jié)果有相似之處，但是也存在一定的差異，表明不同物種CHS基因家族成員在不同品種、不同組織中的表達(dá)水平不盡相同。

木薯塊根PPD是由收獲時(shí)的機(jī)械傷害引起的腐爛變質(zhì)，屬于非生物脅迫的一種。AN等[17]研究發(fā)現(xiàn)大部分類黃酮代謝相關(guān)基因表達(dá)隨著PPD程度升高，包括MeCHS基因，這與本研究中MeCHS在SC8塊根儲存不同時(shí)期的表達(dá)一致，且沉默MeCHS3基因后，塊根變質(zhì)率顯著升高，表明MeCHS3與木薯塊根耐PPD能力呈正相關(guān)[17]。推測在木薯塊根在受到機(jī)械傷害后，MeCHS可通過上調(diào)表達(dá)進(jìn)而增加木薯塊根中類黃酮含量，可通過ROS清除延緩木薯塊根PPD的發(fā)生[30]。后續(xù)可通過在木薯中過表達(dá)MeCHS基因進(jìn)而提高木薯塊根的耐PPD能力。本研究為進(jìn)一步深入研究MeCHS基因在木薯塊根PPD調(diào)控中的功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也可為木薯轉(zhuǎn)基因育種提供一定的參考。

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