劉光霞，陳芳，盧亞敏，牛麗霞，侯瞻，趙連春*

1河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，河北 石家莊 050051；2河北以嶺醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050091

甲狀腺腫瘤為常見的頭頸部腫瘤和內(nèi)分泌腫瘤[1]。甲狀腺癌根據(jù)組織學(xué)特征可分為分化型和未分化型，其中分化型甲狀腺癌約占75%，又可分為乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)和濾泡狀甲狀腺癌(follictalar thyroid carcinoma，F(xiàn)TC)[2-7]。ZCCHC12(含CCHC結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白12)是骨形態(tài)生成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)錄共激活因子[8-10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ZCCHC12在甲狀腺癌組織和細(xì)胞系中呈過(guò)表達(dá)，且可能通過(guò)BMP/SMAD信號(hào)通路促進(jìn)甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，ZCCHC12可激活環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic AMP-response element binding protein，CREB)[12]，而CREB可促進(jìn)人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中p21的表達(dá)[13]，p21上調(diào)對(duì)甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用[14]。截至目前，關(guān)于ZCCHC12調(diào)控CREB/p21信號(hào)通路對(duì)分化型甲狀腺癌的影響鮮少報(bào)道。本研究探討了ZCCHC12對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞HUM-CELL-0097、人PTC細(xì)胞TPC-1由河北省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室保存；人FTC細(xì)胞FTC-133購(gòu)自英國(guó)HHPACC細(xì)胞庫(kù)。ZCCHC12、CREB、p21、E-cadherin、N-cadherin、GAPDH兔單抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；CREB ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Raybiotech公司；p21 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；空質(zhì)粒pcDNA.3.1購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。高速離心機(jī)、移液器購(gòu)自德國(guó)Eppendoff公司；電泳儀購(gòu)自英國(guó)Syngene公司；蛋白凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀、iMark酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自北京醫(yī)療設(shè)備廠；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.2 研究對(duì)象 選取2017年5月－2018年12月河北省人民醫(yī)院收治的50例分化型甲狀腺癌者(設(shè)為分化型甲狀腺癌組)，其中男29例，女21例，年齡42～68(53.5±2.6)歲，PTC 30例，F(xiàn)TC 20例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理學(xué)檢查確診為分化型甲狀腺癌；(2)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有其他系統(tǒng)惡性腫瘤；(2)合并心腦血管、造血系統(tǒng)、肝、腎等疾病；(3)伴有嚴(yán)重感染性疾病、免疫系統(tǒng)疾病；(4)伴有意識(shí)障礙或精神疾??；(5)正接受其他研究。另選取該院同期50名健康體檢者作為健康對(duì)照組。本研究經(jīng)河北省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：K-2018-037)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.3 ELISA法檢測(cè)血清CREB、p21含量 抽取研究對(duì)象的空腹靜脈血3 ml，3500 r/min離心10 min，分離血清。按照CREB、p21 ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟操作，采用iMark酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值，計(jì)算血清CREB、p21含量。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及pcDNA.3.1-CREB過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建 HUM-CELL-0097、TPC-1與FTC-133細(xì)胞分別于含10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和青霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后擴(kuò)增CREB基因序列(GenBank accession number AY347527，包括酶切位點(diǎn)XhoⅠ和EcoRⅠ)。將擴(kuò)增獲得的片段酶切后與空質(zhì)粒pcDNA.3.1連接并測(cè)序，將正確的質(zhì)粒命名為pcDNA.3.1-CREB。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將TPC-1細(xì)胞和FTC-133細(xì)胞分別接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，待細(xì)胞融合至70%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。設(shè)置空白對(duì)照組(正常培養(yǎng)TPC-1或FTC-133細(xì)胞)、NC si組(轉(zhuǎn)染non-specific siRNA)、ZCCHC12 si組(轉(zhuǎn)染ZCCHC12siRNA)、ZCCHC12 si+NC si組(轉(zhuǎn)染ZCCHC12siRNA后，轉(zhuǎn)染non-specific siRNA)、ZCCHC12 si+NC pc組(轉(zhuǎn)染ZCCHC12siRNA后，轉(zhuǎn)染pcDNA.3.1)、ZCCHC12 si+CREB pc組(轉(zhuǎn)染ZCCHC12siRNA后，轉(zhuǎn)染pcDNA.3.1-CREB)、ZCCHC12 si+p21 si組(轉(zhuǎn)染ZCCHC12siRNA后，轉(zhuǎn)染p21 siRNA)。將ZCCHC12 siRNA、p21 siRNA、non-specific siRNA、pcDNA.3.1-CREB和pcDNA.3.1各0.3 μg分別與0.6 μl Turbofect混勻，加入各組細(xì)胞中，37 ℃、5% CO2孵育24 h，采用Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.6 Western blotting檢測(cè)ZCCHC12、CREB、p21、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)量 采用Western blotting檢測(cè)HUM-CELL-009、TPC-1與FTC-133細(xì)胞中CREB、p21蛋白表達(dá)量；空白對(duì)照組、NC si組(轉(zhuǎn)染non-specific siRNA)、ZCCHC12 si組、ZCCHC12 si+NC si組、ZCCHC12 si+NC pc組、ZCCHC12 si+CREB pc組CREB、p21蛋白表達(dá)量；ZCCHC12 si組、ZCCHC12 si+NC si組、ZCCHC12 si+p21 si組p21、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)量。各組加入預(yù)冷的RIPA蛋白抽提試劑，離心后取上清。利用BCA試劑盒定量蛋白。上樣，行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入人源ZCCHC12單抗(1:800)、CREB單抗(1:800)、p21單抗(1:600)、E-cadherin單抗(1:600)、N-cadherin單抗(1:700)和GAPDH兔單抗(1:1000)4 ℃孵育過(guò)夜；TBST清洗，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊源二抗室溫孵育1 h；TBST清洗，X線曝光，采用Image-ProPlus軟件分析。以GAPDH為內(nèi)參，目的蛋白條帶與GADPH條帶灰度值的比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 設(shè)置空白對(duì)照組、ZCCHC12 si組、NC si組、ZCCHC12 si+NC si組和ZCCHC12 si+p21 si組，各組處理方法同1.5，利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。Transwell上層小室中加入細(xì)胞懸液，下層小室加入含5%胎牛血清及0.5%小牛血清的培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，擦去凝膠和濾膜上表面細(xì)胞，經(jīng)蘇木精染色后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 分化型甲狀腺癌患者血清及細(xì)胞系中CREB、p21含量 與健康對(duì)照組比較，分化型甲狀腺癌組血清CREB含量明顯升高(P＆lt;0.05)，p21含量明顯降低(P＆lt;0.01)(圖1A)。與HUM-CELL-0097細(xì)胞比較，TPC-1、FTC-133細(xì)胞中CREB蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，p21蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P＆lt;0.01，圖1B)。

圖1 分化型甲狀腺癌患者血清(n=50)及細(xì)胞系(n=3)中CREB、p21含量Fig.1 Contents of CREB and p21 in serum of patients (n=50) with differentiated thyroid cancer and cell line (n=3)

2.2 干擾ZCCHC12對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲能力的影響 ZCCHC12 si組TPC-1或FTC-133細(xì)胞中ZCCHC12蛋白相對(duì)表達(dá)量較NC si組明顯降低(P＆lt;0.01)，表明ZCCHC12干擾實(shí)驗(yàn)成功(圖2A)。ZCCHC12 si組TPC-1或FTC-133細(xì)胞中E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組和NC si組，N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組和NC si組，細(xì)胞遷移數(shù)明顯少于空白對(duì)照組和NC si組(P＆lt;0.01，圖2)。

圖2 干擾ZCCHC12對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲能力的影響Fig.2 Influence of ZCCHC12 interference on epithelial-mesenchymal transition and invasion of differentiated thyroid cancer cells

2.3 干擾ZCCHC12對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞中CREB、p21蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，ZCCHC12 si組TPC-1或FTC-133細(xì)胞中CREB蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組和NC si組，p21蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組和NC si組(P＆lt;0.01，圖3)。

圖3 干擾ZCCHC12對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞中CREB、p21蛋白表達(dá)的影響(Western blotting, n=3)Fig.3 Influence of ZCCHC12 interference on the protein expressions of CREB and p21 in differentiated thyroid cancer cells(Western blotting, n=3)

2.4 干擾ZCCHC12且過(guò)表達(dá)CREB對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞中p21蛋白表達(dá)的影響 ZCCHC12 si+CREB pc組TPC-1或FTC-133細(xì)胞中CREB蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于ZCCHC12 si+NC pc組和ZCCHC12 si組(P＆lt;0.01)，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功。ZCCHC12 si+CREB pc組TPC-1或FTC-133細(xì)胞中p21蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于ZCCHC12 si組和ZCCHC12 si+NC pc組(P＆lt;0.01，圖4)。

圖4 干擾ZCCHC12且過(guò)表達(dá)CREB對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞中p21蛋白表達(dá)的影響( Western blotting, n=3)Fig.4 Influence of ZCCHC12 interference and CREB overexpression on the protein expression of p21 in differentiated thyroid cancer cells (Western blotting, n=3)

2.5 干擾ZCCHC12和p21對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲能力的影響 ZCCHC12 si+p21 si組TPC-1或FTC-133細(xì)胞中p21蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于ZCCHC12 si+NC si組和ZCCHC12 si組(P＆lt;0.01)，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功(圖5A)。ZCCHC12 si+p21 si組TPC-1或FTC-133細(xì)胞中E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于ZCCHC12 si組和ZCCHC12 si+NC si組，N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于ZCCHC12 si組和ZCCHC12 si+NC si組，細(xì)胞遷移數(shù)明顯多于ZCCHC12 si組和ZCCHC12 si+NC si組(P＆lt;0.01)(圖5)。

圖5 干擾ZCCHC12和p21對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲能力的影響Fig.5 Influence of interference of ZCCHC12 and p21 on epithelial-mesenchymal transition and invasion of differentiated thyroid cancer cells

3 討 論

既往研究發(fā)現(xiàn)，ZCCHC12在甲狀腺癌組織中呈高表達(dá)[11]。ZCCHC12高表達(dá)可明顯促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞CGTH W-3和FTC-133增殖并抑制其凋亡，干擾ZCCHC12則可明顯抑制CGTH W-3和FTC-133細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，表明ZCCHC12對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖和凋亡起調(diào)控作用[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，ZCCHC12可明顯促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞中CREB的表達(dá)[8]，而CREB可抑制小鼠胰島β細(xì)胞中p21的表達(dá)[15]。Ruan等[16]發(fā)現(xiàn)，p21高表達(dá)可有效抑制甲狀腺癌的發(fā)展。截至目前，ZCCHC12通過(guò)CREB/p21通路調(diào)控分化型甲狀腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲能力相關(guān)的研究鮮見。因此，本研究探討了ZCCHC12、CREB和p21在分化型甲狀腺癌細(xì)胞中的調(diào)控關(guān)系，以及對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，干擾ZCCHC12可上調(diào)E-cadherin表達(dá)、下調(diào)N-cadherin表達(dá)，表明干擾ZCCHC12可明顯抑制分化型甲狀腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾ZCCHC12可明顯抑制分化型甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲能力。

Ayroldi等[17]研究發(fā)現(xiàn)，CREB在甲狀腺癌的發(fā)展中起著重要作用，可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。Li等[12]發(fā)現(xiàn)，ZCCHC12可上調(diào)宮頸癌細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CREB的表達(dá)。然而，ZCCHC12對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞中CREB的調(diào)控作用尚未明確。本研究結(jié)果顯示，分化型甲狀腺癌患者血清中CREB含量明顯升高，而抑制分化型甲狀腺癌細(xì)胞中ZCCHC12的表達(dá)后，CREB蛋白表達(dá)量明顯下降。由此可見，在分化型甲狀腺癌中，ZCCHC12可促進(jìn)CREB的表達(dá)，與Li等[12]報(bào)道的宮頸癌細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ZCCHC12對(duì)CREB的正向調(diào)節(jié)作用一致。p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白，作為G1/S期限制點(diǎn)的調(diào)節(jié)因子，可抑制細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，起到抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[18-20]。Li等[21]研究發(fā)現(xiàn)，p21過(guò)表達(dá)可有效抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖。Yang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，p21可促進(jìn)甲狀腺間變性癌細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，干擾lncRNA-HOTAIR可上調(diào)p21的表達(dá)，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力[23]。截至目前，p21對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞侵襲能力的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，分化型甲狀腺癌患者血清中p21含量明顯降低。在分化型甲狀腺癌細(xì)胞中，干擾ZCCHC12可明顯上調(diào)p21蛋白的相對(duì)表達(dá)量，而過(guò)表達(dá)CREB可明顯消除干擾ZCCHC12對(duì)p21表達(dá)的促進(jìn)作用，提示在分化型甲狀腺癌細(xì)胞中，干擾ZCCHC12可通過(guò)CREB促進(jìn)p21的表達(dá)。此外，與干擾ZCCHC12的細(xì)胞比較，同時(shí)干擾ZCCHC12和p21可明顯下調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)、上調(diào)N-cadherin蛋白的表達(dá)，表明干擾p21可有效消除干擾ZCCHC12對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，干擾p21可有效消除干擾ZCCHC12對(duì)分化型甲狀腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。因此，在分化型甲狀腺癌細(xì)胞中，干擾ZCCHC12可通過(guò)CREB增強(qiáng)p21的表達(dá)，進(jìn)而抑制分化型甲狀腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲。有研究發(fā)現(xiàn)，ZCCHC9可通過(guò)與NF-kB啟動(dòng)子結(jié)合抑制MAPK通路[24]，而MAPK通路可激活Notch通路，影響甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖[25]。截至目前，ZCCHC12通過(guò)調(diào)控MAPK通路影響分化型甲狀腺癌細(xì)胞增殖的報(bào)道較少，后期可探討ZCCHC12/MAPK在分化型甲狀腺癌細(xì)胞增殖中的作用。

綜上所述，分化型甲狀腺癌患者血清中CREB含量明顯升高，p21含量明顯降低，干擾分化型甲狀腺癌細(xì)胞中的ZCCHC12可通過(guò)抑制CREB的表達(dá)而促進(jìn)p21的表達(dá)，進(jìn)而抑制分化型甲狀腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲。但本研究未在體內(nèi)探討ZCCHC12、CREB、p21對(duì)分化型甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的作用，后續(xù)需進(jìn)一步進(jìn)行大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討ZCCHC12、CREB、p21對(duì)分化型甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的影響。