蘭偉斌 闕武堂 謝建鴻 涂學(xué)招 胡秀華 邱漢民 （福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院骨科，龍巖 364000）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種關(guān)節(jié)退行性病變，特征為關(guān)節(jié)軟骨破壞、軟骨下骨硬化和骨贅形成，主要臨床表現(xiàn)為疼痛和功能障礙，可導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降［1］。軟骨穩(wěn)態(tài)反映了軟骨素合成代謝和分解代謝平衡。但OA發(fā)病機(jī)制尚不清楚。OA進(jìn)展涉及多種因素，其中關(guān)節(jié)軟骨降解主要與分解軟骨的蛋白過量產(chǎn)生有關(guān)，包括基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS）和其他分解代謝酶［2］。MMP-1、MMP-3 和MMP-13在OA 軟骨退化中起重要作用，而ADAMTS-4 是最有效的聚集蛋白聚糖酶，與OA 發(fā)病機(jī)制相關(guān)［3-4］。MMP-13 切割collagen Ⅱ，而ADAMTS-4 降解蛋白多糖［5］。非甾體類抗炎藥是OA主要治療方法之一，雖然該類藥物可緩解患者臨床癥狀，但無法保護(hù)軟骨免受進(jìn)一步損傷。因此迫切需要探索新的抑制關(guān)節(jié)軟骨退化的藥物。大黃素（1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌）是一種從掌葉大黃根莖中分離的天然蒽醌，具有抗菌、抗癌和抗炎活性［6-8］。此外，大黃素在多種細(xì)胞中具有抑制MMPs（包括MMP-2和MMP-9）的作用［9］。本研究檢測了大黃素對IL-1β 刺激的大鼠軟骨細(xì)胞MMP-13 和ADAMTS-4 表達(dá)的影響，以及對細(xì)胞內(nèi)NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)的影響，以期揭示大黃素對OA軟骨降解的治療價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 體質(zhì)量200～220 g 的雄性Sprague-Dawley 大鼠（南京君科生物工程有限公司）；0.1%膠原酶、10%胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基（Gibco BRL）；大黃素（Sigma-Aldrich）；MTT（碧云天生物技術(shù)研究所）；Hoechst33324（Solarbio）；重組大鼠IL-1β（Pepro-Tech）；Trizol 試劑（Invitrogen）；Primescript-RT 試劑盒（Ta-KaRa）；0.1%番紅O（Sigma）；所有一抗（Cell Signaling Technology）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Abcam）；酶標(biāo)儀（Bio-Rad）；ABI PRISM 7700 型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞獲取 從雄性SD大鼠膝蓋和股骨頭處收集關(guān)節(jié)軟骨，PBS沖洗3次并切成小塊，0.1%膠原酶孵育3 h釋放軟骨細(xì)胞，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，融合的軟骨細(xì)胞按1∶3傳代，第2代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT 檢測細(xì)胞活力 大黃素溶于DMSO，用前過濾滅菌。軟骨細(xì)胞接種于96孔板（1×104個(gè)/孔）， 與10～100 μmol/L 大黃素共培養(yǎng)24 h、48 h，在指定時(shí)間20 μl/孔加入MTT（5 mg/ml），37 ℃培養(yǎng)4 h，除去培養(yǎng)基，150 μl/孔加入DMSO，酶標(biāo)儀測量570 nm處吸光度。將無大黃素的孔作為正常對照組，無細(xì)胞的孔作為空白組。細(xì)胞存活率（%）=（大黃素處理孔平均OD 值-空白孔平均OD 值）/（正常對照孔平均OD值-空白孔平均OD值）×100%。

1.2.3 Hoechst 染色檢測大黃素對軟骨細(xì)胞的毒性 不同劑量大黃素處理細(xì)胞48 h，Hoechst33324（10 μg/ml）染色30 min，BX51 熒光顯微鏡下觀察?；罴?xì)胞核DNA 染成藍(lán)色，而凋亡或壞死細(xì)胞可通過凝聚或片段化藍(lán)染核識(shí)別。

1.2.4 體外細(xì)胞處理 將培養(yǎng)板中的融合單層軟骨細(xì)胞用完全培養(yǎng)基洗滌3 次，無血清培養(yǎng)基孵育過夜。分別將血清饑餓的軟骨細(xì)胞分為3 類：①單獨(dú)用重組大鼠IL-1β（10 ng/ml）預(yù)處理24 h；②采用20 μmol/L 大黃素預(yù)處理2 h，IL-1β（10 ng/ml）孵育24 h；③未經(jīng)處理。不同時(shí)間點(diǎn)收獲軟骨細(xì)胞用于RT-PCR和Western blot分析。

1.2.5 RT-PCR 按照Trizol 試劑說明從大鼠軟骨細(xì)胞中提取總RNA，采用Primescript-RT 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，ABI PRISM 7700 型熒光定量PCR 儀進(jìn)行RT-PCR，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，以GAPDH 為內(nèi)參。引物序列為collagen ⅡF：5'-GGTAAGTGGGGCAAGACTGTTA-3'，R：5'-TGTTGTTTCTGGGTTCAGGTTT-3'；aggrecan F：5'-GTCAGATACCCCATCCACACTC-3'，R：5'-CATAAAAGACCTCACCCTCCAT-3'；MMP-13 F：5'-AGCCACTTTATGCTTCCTGATG-3'，R：5'-GATGTTTAGGGTTGGGGTCTTC-3'；ADAMTS-4 F：5'-ACAGGCAGGGAGAGACAAAGAT-3'，R：5'-C- CAAGGTCAGAGGCAAAGTT-3'；NF-κB p65 F：5'- TGCATTCTGACCTTGCCTAT-3'，R：5'-TCCAGTCTCCGAGTGAAGC-3'；IKK-β F：5'-CCGTGACTGTTGACTACT-3'，R：5'-GTCCACTTCGCTCTTCTG-3'；IκB-α F：5'-CAAGTACCCGGATACAGCAG-3'，R：5'-ACACAGTCATCGTAGGGCAA-3'；β-catenin F：5'-GTTGCTCCACTCCAGGAATGAAGG-3'，R：5'-GCACCAATGTCCAGTCCGAGATC-3'；GAPDH F：5'-AGTTCAACGGCACAGTCAAGGC-3'，R：5'-GACATACTCAGCACCAGCATCACC-3'。ΔΔCt法分析相對表達(dá)。

1.2.6 細(xì)胞番紅O 染色 為了評估軟骨特異性基質(zhì)蛋白糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAG），將軟骨細(xì)胞接種至6孔板（2×104個(gè)/孔），分別給予20 μmol/L 大黃素和10 ng/ml IL-1β處理，每48 h用新鮮含大黃素和IL-1β 的培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d 后吸出培養(yǎng)基，PBS 洗滌3 次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌2 次，0.1%番紅O 儲(chǔ)備液室溫孵育30 min，除去染料，PBS洗滌，拍攝染色結(jié)果。

1.2.7 Western blot PBS 洗滌大鼠軟骨細(xì)胞后裂解20 min，BCA 法測量蛋白濃度，95 ℃變性5 min，SDS-PAGE 分離總裂解物蛋白（30 μg/泳道）轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗滌，加入稀釋的一抗aggrecan（1∶1 000）、collagen Ⅱ（1∶1 000）、MMP-13（1∶3 000）、ADAMTS-4（1∶2 000）、NF-κB p65 （1∶2 000）、IKK-β（1∶1 000）、IκB-α（1∶1 000）、 β-catenin（1∶2 000）和β-actin（1∶1 000） 4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶2 000）二抗室溫孵育1 h，ECL，檢測蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0 軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)表示為±s。采用t檢驗(yàn)比較兩組間差異，單因素方差分析（ANOVA）和LSD 檢驗(yàn)比較多組間差異。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃素對軟骨細(xì)胞活力的影響 MTT 和Hoechst 染色結(jié)果表明，10～100 μmol/L 大黃素孵育24 h 和48 h 后，大黃素對軟骨細(xì)胞無顯著細(xì)胞毒性作用（P＞0.05，圖1）。

圖1 大黃素對軟骨細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of emodin on chondrocyte viability

2.2 大黃素對IL-1β 誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞aggrecan和COL2A1 表達(dá)的影響 RT-PCR 結(jié)果顯示，IL-1β（10 ng/ml）誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞中aggrecan 和COL2A1 mRNA 水平顯著降低，而20 μmol/L 大黃素處理的軟骨細(xì)胞兩種基因表達(dá)顯著高于僅用IL-1β處理的細(xì)胞（圖2）。Western blot 評估aggrecan 和COL2A1蛋白表達(dá)，結(jié)果與RT-PCR一致。

圖2 大黃素對aggrecan和COL2A1表達(dá)的影響Fig.2 Effects of emodin on aggrecan and COL2A1 expressions

2.3 大黃素對IL-1β 誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞合成蛋白多糖GAG 的影響 番紅O 染色證實(shí)了軟骨細(xì)胞合成蛋白多糖GAG 的過程，GAG 在IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中表達(dá)顯著低于大黃素處理的軟骨細(xì)胞（圖3）。

圖3 番紅O染色結(jié)果Fig.3 Safranin O staining results

2.4 大黃素對IL-1β 誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞MMP-13和ADAMTS-4表達(dá)的影響 與未處理的大鼠軟骨細(xì)胞相比，IL-1β（10 ng/ml）刺激的軟骨細(xì)胞MMP-13 mRNA 表達(dá)顯著升高，而20 μmol/L 大黃素預(yù)處理可顯著抑制IL-1β 誘導(dǎo)的MMP-13 表達(dá)上調(diào)。Western blot 結(jié)果與RT-PCR 一致（圖4）。與未用IL-1β 刺激的大鼠軟骨細(xì)胞相比，IL-1β（10 ng/ml）處理后， ADAMTS-4 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著升高，大黃素預(yù)處理則可顯著抑制ADAMTS-4表達(dá)。

圖4 大黃素對MMP-13和ADAMTS-4表達(dá)的影響Fig.4 Effects of emodin on MMP-13 and ADAMTS-4 expressions

2.5 大黃素對IL-1β 誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響 IL-1β（10 ng/ml）預(yù)處理可顯著提高IKK-β 和NF-κB p65 表達(dá)，并降低IκB-α 表達(dá)，但20 μmol/L大黃素處理則可抑制上述過程，說明IL-1β 預(yù)處理可激活NF-κB 信號(hào)通路，但大黃素可通過抑制IκB-α降解下調(diào)IKK-β和NF-κB p65水平。Western blot結(jié)果與RT-PCR一致（圖5）。

圖5 大黃素對NF-κB p65、IKK-β和IκB-α表達(dá)的影響Fig.5 Effects of emodin on NF-κB p65， IKK-β and IκB-α expressions

3 討論

OA 是一種由年齡增長、創(chuàng)傷、肥胖、關(guān)節(jié)畸形或先天性異常等因素引起的關(guān)節(jié)退行性病變，主要特征包括關(guān)節(jié)軟骨破壞、軟骨下骨硬化、骨贅形成等，可導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、腫脹、活動(dòng)受限等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［10-12］。根據(jù)病因可將OA 分為原發(fā)性O(shè)A 和繼發(fā)性O(shè)A，原發(fā)性O(shè)A 發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與患者年齡、體重、勞動(dòng)程度有關(guān)。而繼發(fā)性O(shè)A 主要由炎癥、神經(jīng)缺陷、代謝異常、內(nèi)分泌異常等因素引起［13-15］。軟骨穩(wěn)態(tài)反映了軟骨素合成代謝和分解代謝平衡，在OA 進(jìn)展中具有重要作用，關(guān)節(jié)軟骨降解主要與分解軟骨的蛋白過量產(chǎn)生有 關(guān)，包 括MMP-1、MMP-3 和MMP-13、ADAMTS等［16-18］。而這些蛋白由受多種信號(hào)調(diào)節(jié)，其中，NF-κB 是調(diào)節(jié)炎癥基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在OA進(jìn)展中起重要作用［19］。

目前OA 治療主要采用非甾體類抗炎藥和其他緩解疼痛的藥物，但這些藥物均無法阻止軟骨退化。此外，長期使用非甾體類抗炎藥可能導(dǎo)致嚴(yán)重胃腸道、腎臟和心血管方面不良反應(yīng)［20］。因此，開發(fā)更有效和安全的藥物用于OA 治療非常需要。大黃素是一種從掌葉大黃根莖中分離的天然蒽醌，具有抗炎作用，且已廣泛用于臨床［21］。GAO 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，大黃素降低了鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠早期蛋白尿和纖維連接蛋白表達(dá)，在預(yù)防糖尿病早期腎功能不全方面具有一定應(yīng)用價(jià)值。王少杰等［23］考察了大黃素在DL-乙硫氨酸和四環(huán)素誘導(dǎo)的小鼠急性脂肪肝中的作用，發(fā)現(xiàn)大黃素可有效改善小泡型肝脂肪變性及肝細(xì)胞腫大，增加脂肪酸氧分泌、減少肝臟脂肪酸攝取，對脂肪肝具有較好改善作用。大黃素通過抑制促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-8 以及MMP-1 和MMP-13 等MMPs 抑制炎癥反應(yīng)［24-25］。任凱旋等［26］探討了大黃素對脂多糖誘導(dǎo)小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)大黃素可通過PPARγ/NF-κB 信號(hào)通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，提示大黃素在炎癥相關(guān)性疾病治療中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。彭菲菲等［27］考察了大黃素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度大黃素可顯著抑制體外培養(yǎng)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞轉(zhuǎn)移及增殖，說明大黃素治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有較高應(yīng)用前景。但目前大黃素在OA 發(fā)病機(jī)制及臨床治療中的作用和價(jià)值尚不明確，因此本研究探討了大黃素的潛在軟骨保護(hù)作用。

關(guān)節(jié)軟骨是一種結(jié)構(gòu)精細(xì)、表面光滑、減少骨摩擦、緩沖振動(dòng)等多功能膠原纖維構(gòu)成的軟骨，在關(guān)節(jié)活動(dòng)中具有關(guān)鍵作用。運(yùn)動(dòng)過程中，關(guān)節(jié)軟骨可承受力學(xué)負(fù)荷、緩沖運(yùn)動(dòng)壓力、潤滑作用、增加關(guān)節(jié)靈活性等，是一種專門的連接組織，其細(xì)胞外基質(zhì)主要由大分子組成，包括軟骨中最豐富的蛋白多糖aggrecan 和collagenⅡ［28］。葡聚糖酶介導(dǎo)的aggrecan 降解發(fā)生在軟骨破壞初始階段，使膠原蛋白纖維對膠原酶更加敏感［28］。IL-1β 在體外研究中廣泛用于誘導(dǎo)OA，因此本研究采用IL-1β 對大鼠軟骨細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)［29］。IL-1β 可降低軟骨細(xì)胞aggrecan 和collagenⅡmRNA 和蛋白水平，而大黃素預(yù)處理的細(xì)胞中，aggrecan 和collagenⅡ表達(dá)顯著上調(diào)。此外，大黃素處理的軟骨細(xì)胞蛋白多糖GAG沉積增加。

膠原蛋白降解主要通過膠原蛋白降解MMPs 進(jìn)行，這些酶的表達(dá)增加與OA 進(jìn)展密切相關(guān)［30］。MMPs 組中，MMP-13 對細(xì)胞外基質(zhì)collagenⅡ蛋白具有強(qiáng)大水解作用，是參與OA 軟骨退變的主要酶［31］。因此，抑制MMP-13 表達(dá)可能具有軟骨保護(hù)作用。本研究顯示，與未處理的大鼠軟骨細(xì)胞相比，IL-1β 刺激的軟骨細(xì)胞MMP-13 表達(dá)顯著升高，而大黃素預(yù)處理則可顯著抑制MMP-13 上調(diào)。聚集蛋白聚糖酶屬于ADAMTS 家族，與關(guān)節(jié)疾病相關(guān)的聚集蛋白聚糖酶是ADAMTS-4［32］。敲除這些酶中的任何一種均會(huì)減弱炎癥遞質(zhì)刺激的軟骨細(xì)胞aggrecan 降解，減弱aggrecan 降解可提供更強(qiáng)的OA 保護(hù)作用［33］。本研究顯示，IL-1β 誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞ADAMTS-4 顯著增加，大黃素預(yù)處理則可顯著抑制ADAMTS-4表達(dá)。因此推測大黃素的軟骨保護(hù)作用主要通過阻斷MMP和ADAMTS表達(dá)和活化阻止OA進(jìn)展。

NF-κB 是炎癥基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在OA 進(jìn)展中起重要作用［34］。通常NF-κB 與其抑制蛋白IκB-α 以無活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)，而抑制蛋白IκB-α降解受IKK-β調(diào)節(jié)。促炎細(xì)胞因子，如IL-1β刺激可導(dǎo)致IKK-β 活化，磷酸化IκBα 并將NF-κB 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，激活炎癥相關(guān)基因表達(dá)，包括COX-2、TNF-α、IL-6、MMPs和ADAMTS［35-40］。本研究觀察到IL-1β 預(yù)處理可顯著提高IKK-β 和NF-κB p65表達(dá)，并降低IκB-α 表達(dá)，但20 μmol/L 大黃素處理則可抑制上述過程，說明IL-1β 預(yù)處理可激活 NF-κB信號(hào)通路，但大黃素處理可通過抑制IκB-α降解下調(diào)IKK-β 和NF-κB p65 表達(dá)，并最終抑制NF-κB p65 活化。因此推測大黃素對MMP 和ADAMTS 表達(dá)的抑制作用部分歸因于其對NF-κB途徑的抑制。

綜上，本研究表明，大黃素可提高IL-1β 誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞aggrecan 和COL2A1 表達(dá)，并顯著抑制IL-1β 誘導(dǎo)的MMP-13 和ADAMTS-4 上調(diào)，此外，大黃素處理可通過抑制IκB-α 降解下調(diào)IKK-β 和NF-κB p65 水平，提示大黃素對MMP 和ADAMTS 表達(dá)的抑制作用部分歸因于其對NF-κB 途徑的抑制，從而發(fā)揮軟骨保護(hù)作用。