姬霄霄 李 振 郝慧琴 高玉亭 （山西中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室，晉中 030619）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性炎癥性疾病，主要病理特征為持續(xù)性滑膜炎、血管炎和軟骨破壞，后期可侵犯骨關(guān)節(jié)，引起不可逆關(guān)節(jié)損傷，嚴(yán)重者可導(dǎo)致殘疾［1-2］。RA 西醫(yī)治療集中于非甾體抗炎藥、改善病情抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素等藥物，雖可改善RA 癥狀，但其不良反應(yīng)極大降低了患者用藥依從性［3］。中藥復(fù)方在中醫(yī)傳統(tǒng)辨證思想指導(dǎo)下具有多靶點(diǎn)多療效特點(diǎn)，在中藥復(fù)方中尋找安全有效的RA 治療措施具有潛在研究價(jià)值。

防己黃芪湯（Fangji Huangqi Decoction，F(xiàn)HD）首見于《金匱要略》，由防己、黃芪、白術(shù)、甘草組成，加生姜和大棗煎服，可祛風(fēng)除濕、健脾利水，是臨床治療RA 的經(jīng)典方劑。研究表明，F(xiàn)HD 具有抗氧化、殺菌、抗炎、鎮(zhèn)痛作用，在風(fēng)濕免疫、腎病、循環(huán)系統(tǒng)疾病中應(yīng)用廣泛［4］。另有研究證實(shí)，F(xiàn)HD 可有效緩解膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠關(guān)節(jié)腫脹度，抑制關(guān)節(jié)滑膜血管新生，降低TNF-α 體外誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞MH7A 遷移、侵襲及黏附能力［5-6］。FHD 治療RA 的藥理學(xué)機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測得到FHD 治療RA 的核心通路為PI3K-Akt 通路，通過構(gòu)建CIA大鼠模型，進(jìn)一步探索FHD對CIA大鼠PI3KAkt 通路的調(diào)控作用，為后期FHD 臨床治療RA 提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 60 只6～8 周齡SPF 級健康雌性Wistar 大鼠，體質(zhì)量（200±10） g，購自北京市昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場，動物許可證號：SCXK（京）2019-0010， 實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，（23±2） ℃，（50±15）%濕度，自由進(jìn)食飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（2019LL156）。

1.1.2 藥材及試劑 防己、黃芪、白術(shù)、甘草均購自山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；牛Ⅱ型膠原（Chondrex，20022）；弗 氏 完 全/不 完 全 佐 劑（Sigma， SLBR3877V、SLBM9362V）；大鼠TNF-α、IL-1、IL-6 ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物，202105）；HE 染色液（雷根生物，DH0006）；一抗PI3K、Akt、p-Akt（Ser473，CST，4257、4685、4060）；p-PI3K（Y607，Abcam，AB182651）；β-actin（ABclonal，AC038）；二抗羊抗兔IgG（Solarbio，SE134）；RIPA 裂解液、PMSF、蛋白磷酸酶 抑 制劑、BSA、EDTA 脫鈣液（Solarbio，R0020、P0100、P1260、SW3015、E1171）；BCA、SDS-PAGE 試劑盒（Boster，AR0146、AR0138）；ECL 發(fā)光液（百奧生物，M1033）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及CIA 造模 60 只Wistar 大鼠隨機(jī)分為健康對照組（Control）、CIA 模型組（CIA）、低劑量FHD 治療組（Low-FHD）、中劑量FHD 治療組（Medium-FHD）、高劑量FHD治療組（High-FHD），每組12 只。牛Ⅱ型膠原和弗氏完全/不完全佐劑誘導(dǎo)CIA 大鼠模型［7］。初次免疫：冰上將牛Ⅱ型膠原與弗氏完全佐劑混勻乳化，終濃度為1 mg/ml，除Control 組外，分別在大鼠背部、尾跟部2 cm 處和右后足掌中心行5點(diǎn)皮下注射乳化劑（0.1 ml/點(diǎn)）。加強(qiáng)免疫：1 周后，牛Ⅱ型膠原和弗氏不完全佐劑等量混合，腹腔注射乳化劑（0.3 ml/只）。

1.2.2 給藥方法及取材 初次免疫2周后（0周）開始給藥，F(xiàn)HD（防己∶黃芪∶白術(shù)∶甘草=4∶5∶3∶2）傳統(tǒng)水煎法煎煮。按照人體表面積公式將人的用藥劑量轉(zhuǎn)換為大鼠用藥劑量，低、中、高FHD 劑量分別為2.2、4.4、8.8 g/（kg·d），2 次/d，連續(xù)灌胃6 周，Control組和CIA組大鼠灌胃4.4 g/（kg·d）生理鹽水。治療結(jié)束后，10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉大鼠，腹主動脈取血，離心，取上清，-80 ℃保存，脫頸處死大鼠，取左踝關(guān)節(jié)-80 ℃保存，右踝關(guān)節(jié)和脾臟用4%多聚甲醛固定。

1.2.3 大鼠體質(zhì)量及關(guān)節(jié)炎評分 給藥0～6周，根據(jù)表1 關(guān)節(jié)炎評分標(biāo)準(zhǔn)，每周記錄各組大鼠體質(zhì)量和關(guān)節(jié)炎評分，四肢累積得分即為每只大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)［8］。

表1 關(guān)節(jié)炎評分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Standard of arthritis score

1.2.4 不同實(shí)驗(yàn)組大鼠關(guān)節(jié)和脾臟病理學(xué)檢測 取4%多聚甲醛固定的大鼠踝關(guān)節(jié)（10%EDTA 脫鈣5 周）和脾臟，梯度乙醇脫水→二甲苯透明→石蠟包埋→4 μm 切片→脫蠟至水→HE 染色，顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)和脾臟病理變化。關(guān)節(jié)組織以滑膜增生、細(xì)胞浸潤、血管翳形成和軟骨侵蝕4 個特征進(jìn)行病理評分，評分范圍為0 分（無影響）至3 分（嚴(yán)重影響），脾臟組織以淋巴樣白髓增生和生發(fā)中心總數(shù)2個特征進(jìn)行病理評分，評分范圍為0 分（無影響）至4 分（嚴(yán)重影響）［9］。

1.2.5 血清炎癥因子檢測 ELISA 試劑盒檢測各組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6 表達(dá)。按照說明書依次稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，取各組大鼠血清各50 μl，450 nm 處檢測OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。

1.2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測FHD 治療RA 的核心信號通路 借助PubMed、TCMSP、BATAMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫收集FHD 化學(xué)成分［10-11］。TCMSP 數(shù)據(jù)庫以O(shè)B≥30%、DL≥0.18、AlogP≤5、MW≤500 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，BATMAN-TCM 數(shù) 據(jù) 庫 以Score cut off＞30，P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選［12］。Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行活性成分-靶標(biāo)預(yù)測［13］。Uniprot 數(shù)據(jù)庫對預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理［14］。利用OMIM、GeneCards、Dis-GeNET 數(shù)據(jù)庫以score＞平均值篩選RA 疾病靶點(diǎn)［15-17］。將FHD 治療RA 的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置蛋白互作評分≥0.9，獲得PPI 數(shù)據(jù)，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯愿鞴?jié)點(diǎn)度值（degree）、介數(shù)中心值（closeness）及緊密關(guān)系值 （betweenness）參數(shù)＞平均值篩選FHD 治療RA 的核心靶點(diǎn)［18］。以P＜0.01 為條件，DAVID 數(shù)據(jù)庫對核心靶點(diǎn)進(jìn)行信號通路富集分析，獲得FHD 治療RA的核心信號通路［19］。

1.2.7 基于PI3K-Akt 信號通路檢測各組大鼠關(guān)節(jié)PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達(dá) 液氮研磨大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織至粉末狀，RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA 檢測蛋白濃度和純度，取30 μg 蛋白上樣，SDSPAGE電泳，5%濃縮膠（80 V，30 min）和10%分離膠（120 V，90 min）濕轉(zhuǎn)（230 mA，90 min）至PVDF 膜，5%BSA 室 溫封 閉1 h，分 別 加入 兔 源PI3K、Akt、 p-PI3K（Y607）、p-Akt（Ser473）抗體（1∶1 000）、β-actin 抗體（1∶5 000） 4 ℃孵育過夜（12～16 h），加入羊抗兔IgG 二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST 充分洗膜，eECL（A 液、B 液各500 μl）避光顯色，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以±s表示，不同時間段各組比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的兩因素方差分析，多組間比較采用單因素方差分析，符合方差齊性采用LSD-t檢驗(yàn)，不符合方差齊性采用Dunnett T3 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量和關(guān)節(jié)炎評分 給藥0～6周，CIA 組大鼠體質(zhì)量較Control 組顯著降低（P＜0.01），給藥4 周后，不同劑量FHD 治療組較CIA 組大鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.01），F(xiàn)HD 高劑量組大鼠體質(zhì)量呈下降趨勢（圖1A）。CIA 組與不同劑量FHD 治療組關(guān)節(jié)炎評分顯著高于Control 組（P＜0.01），給藥 5 周后，不同劑量FHD 治療組關(guān)節(jié)炎評分顯著降低（P＜0.01，圖1B）。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量和關(guān)節(jié)炎評分Fig.1 Body weight and arthritis score of rats in each group

2.2 各組大鼠關(guān)節(jié)和脾臟病理學(xué)檢測 HE 染色結(jié)果顯示，Control 組大鼠關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)完整。CIA組關(guān)節(jié)腔內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤，皮下滑膜組織增生伴血管翳形成，關(guān)節(jié)面粗糙，軟骨破壞明顯；與CIA組相比，不同劑量FHD 組大鼠關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)改善，無明顯滑膜血管翳形成，可顯著抑制滑膜增生和炎癥細(xì)胞浸潤（圖2A）。CIA 大鼠脾臟內(nèi)淋巴樣白髓和主要生發(fā)中心增生明顯，不同劑量FHD 均可顯著減少生發(fā)中心總數(shù)并抑制白髓增生（圖2B）。

圖2 各組大鼠關(guān)節(jié)和脾臟病理改變及評分（×40）Fig.2 Pathological changes and scores of joints and spleen of rats in each group （×40）

2.3 各組大鼠血清炎癥因子表達(dá) ELISA 結(jié)果顯示，與Control 組相比，CIA 組大鼠血清TNF-α、IL-1和IL-6 表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與CIA 組相比，低、中FHD劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1和IL-6表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），高劑量組TNF-α、IL-1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。

圖3 各組大鼠血清細(xì)胞因子水平Fig.3 Serum cytokine level of rats in each group

2.4 FHD 治療RA 的核心信號通路預(yù)測 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，F(xiàn)HD 有效活性成分共270 個（防己 30 個、黃芪44 個、白術(shù)14 個、甘草190 個，黃芪和甘草共有成分8 個），潛在作用靶點(diǎn)762 個，RA 疾病靶點(diǎn)1 670 個，F(xiàn)HD 治療RA 潛在靶點(diǎn)250 個（圖4）。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示（表2），PPI網(wǎng)絡(luò)中各蛋白節(jié)點(diǎn)degree、closeness 和betweenness 平 均 值 分 別 為13.26、0.35、0.018，篩選出FHD 治療RA 的核心靶點(diǎn)30 個。核心靶點(diǎn)KEGG 富集分析結(jié)果表明：PI3K-Akt 通路為核心靶點(diǎn)富集最多的通路，提示FHD可能通過該通路發(fā)揮RA治療作用（圖5）。

圖5 核心靶點(diǎn)KEGG信號通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis of core target KEGG signaling pathway

表2 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)Tab.2 Network topology parameters of core targets

圖4 FHD治療RA的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network in FHD therapy of RA

2.5 各組大鼠關(guān)節(jié)PI3K-Akt通路蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，與Control組比較，CIA組p-PI3K、p-Akt表達(dá)顯著升高（P＜0.01），與CIA 組相比，不同劑量FHD 組大鼠關(guān)節(jié)PI3K、Akt 蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.01），各組大鼠PI3K、Akt表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖6A）。PI3K-Akt信號通路激活可調(diào)控細(xì)胞的存活、凋亡、增殖和分化，F(xiàn)HD 可能通過抑制p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)負(fù)調(diào)控PI3K-Akt 信號通路，進(jìn)而抑制CIA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖和破骨細(xì)胞分化、脾臟中淋巴細(xì)胞增殖、炎癥因子釋放緩解CIA 大鼠關(guān)節(jié)和脾病理損傷，發(fā)揮治療作用 （圖6C）。

圖6 各組大鼠關(guān)節(jié)PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達(dá) 及FHD治療CIA大鼠的調(diào)控機(jī)制Fig.6 Protein expressions of PI3K， p-PI3K， Akt and p-Akt in joints of rats in each group and regulatory mechanism of FHD in CIA rats

3 討論

中醫(yī)經(jīng)典復(fù)方治療RA 具有獨(dú)特優(yōu)勢，臨床控制中藥用量對疾病治療十分重要，堅(jiān)持“效毒權(quán)衡”原則才能達(dá)到最佳量效關(guān)系，指導(dǎo)臨床辨治疾?。?0］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量FHD 均可顯著緩解CIA 大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀，但高劑量FHD 組大鼠體質(zhì)量自給藥4 周后呈下降趨勢，血清TNF-α 和IL-1 表達(dá)較CIA 組無明顯變化，提示8.8 g/（kg·d）FHD 可能產(chǎn)生毒副作用進(jìn)而影響大鼠體質(zhì)量且尚未影響血清TNF-α 和IL-1 炎癥因子表達(dá)，推薦FHD 安全用藥劑量為2.2～4.4 g/（kg·d）。

TNF-α 主要由巨噬細(xì)胞和Th1 細(xì)胞分泌，在RA滑膜中廣泛存在，能夠促進(jìn)IL-1、IL-6 等炎癥因子產(chǎn)生并形成級聯(lián)反應(yīng)，加重RA 炎癥反應(yīng)［21-22］。研究證實(shí)，RA 成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）可被IL-1、IL-6、TNF-α 在內(nèi)的各種細(xì)胞因子激活，組織蛋白酶（CAT）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）高表達(dá)，膠原蛋白和蛋白聚糖分解，導(dǎo)致軟骨和骨骼破壞及關(guān)節(jié)侵蝕［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HD 可顯著緩解CIA 大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀，抑制關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤、滑膜增生和軟骨破壞，降低血清TNF-α、IL-1、IL-6 表達(dá)，提示FHD 可能通過抑制炎癥因子生成緩解CIA 大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀。

PI3K-Akt 通路可調(diào)控RA-FLS 增殖和凋亡，在RA炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［24-25］。研究表明，TNF-α等炎癥因子通過激活PI3K/Akt 通路大量釋放IL-1、IL-6等促炎因子，持續(xù)誘導(dǎo)FLS 增殖和炎癥反應(yīng)，加重RA 病情［26］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt 通過促進(jìn)破骨細(xì)胞形成與分化進(jìn)而破壞骨質(zhì)與關(guān)節(jié)軟骨，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、僵硬，抑制該通路活化可能成為RA治療的新途徑［27］。MENG等［28］研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3KAkt 信號通路可促進(jìn)IL-1β 刺激的RA-FLS 凋亡，降低TNF-α 和IL-6 表達(dá)。FENG 等［29］研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/Akt/mTOR 途徑可減少CIA 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖并加速細(xì)胞凋亡和自噬，有效改善關(guān)節(jié)炎癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)，CIA組大鼠關(guān)節(jié)p-PI3K和p-Akt表達(dá)顯著增多，PI3K-Akt 通路異常激活，而不同劑量FHD 組p-PI3K 和p-Akt 表達(dá)較CIA 顯著降低，推測FHD 通過抑制PI3K-Akt 信號通路活化緩解CIA 大鼠炎癥反應(yīng)和改善病理破壞。

綜上，不同劑量FHD 均可緩解CIA 大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀，抑制關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜增生和軟骨破壞，減少脾臟中白髓增生，降低血清炎癥因子表達(dá)，安全用藥范圍為2.2～4.4 g/（kg·d），其作用機(jī)制可能與抑制PI3K-Akt 信號通路活化有關(guān)。本研究對闡明FHD治療RA 的作用機(jī)制，及通過PI3K-Akt 信號通路靶向治療RA具有重要意義。