王立芹 陳紅營 隋 英 賈榮軍 沈 亮 （德州市人民醫(yī)院兒科，德州 253000）

小兒哮喘是臨床常見的一種疾病類型，由支氣管上皮細胞損傷與功能障礙導致，在外界刺激性物質(zhì)作用下支氣管上皮細胞結(jié)構(gòu)及功能被破壞而產(chǎn)生炎癥因子，炎癥因子大量釋放與細胞凋亡數(shù)量增加是引起哮喘患兒支氣管上皮細胞損傷的重要原因，目前人支氣管上皮細胞損傷的分子機制尚未完全闡明［1-2］。研究表明長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在重癥哮喘患者中表達異常，并可能參與哮喘的形成機制，還可調(diào)節(jié)支氣管上皮細胞凋亡、炎癥等生物學過程［3-4］。lncRNA OIP5-AS1在屋塵螨誘導的人支氣管上皮細胞中表達升高， 并可通過miR-143-3p/HMGB1 軸促進屋塵螨誘導 的人支氣管上皮細胞炎癥反應［5］。本研究通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)OIP5-AS1 與miR-7-5p 存在結(jié)合位點。本研究采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導人支氣管上皮細胞建立細胞損傷模型，探討OIP5-AS1/miR-7-5p 分子軸在人支氣管上皮細胞損傷發(fā)生過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人支氣管上皮細胞16HBE 購自武漢普諾賽生命科技有限公司；LPS 購自美國Sigma 公司；凋亡試劑購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司； Lipofectamine2000 購自美國Invitrogen 公司；si-NC、si-OIP5-AS1、miR-NC、miR-7-5p mimics、anti-miRNC、anti-miR-7-5p 購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol 試劑購自北京全式金生物；反轉(zhuǎn)錄與熒光定量檢測試劑購自北京天根；IL-6、IL-8 檢測試劑盒購自美國R&D；MTT 試劑購自上海信帆生物；一抗購自美國Santa Cruz；二抗購自美國Abcam。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 16HBE 細胞接種于含100 ng/ml LPS 的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)24 h，設為LPS 組［6］。同時將正常培養(yǎng)的16HBE 細胞設為Con 組。分別將si-NC、 si-OIP5-AS1、miR-NC、miR-7-5p mimics、si-OIP5-AS1與anti-miR-NC、si-OIP5-AS1 與anti-miR-7-5p 轉(zhuǎn)染至16HBE 細胞后加入含100 ng/ml LPS 的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)24 h，分別設為LPS+si-NC組、LPS+si-OIP5-AS1組、LPS+miR-NC 組、LPS+miR-7-5p 組、LPS+si-OIP5-AS1+anti-miR-NC組、LPS+si-OIP5-AS1+anti-miR-7-5p組。

1.2.2 qRT-PCR 檢測細胞中OIP5-AS1、miR-7-5p表達水平 采用Trizol 法提取各組16HBE 細胞總RNA 后檢測其濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)熒光定量PCR 試劑盒說明書檢測OIP5-AS1、miR-7-5p相對表達量。

1.2.3 ELISA 法檢測IL-6、IL-8 水平 收集各組細胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA 試劑盒檢測IL-6、IL-8 的表達水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 MTT 檢測細胞增殖 收集各組16HBE 細胞接種于96 孔板（100 μl/孔），每孔加入20 μl MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄上清，每孔加入150 μl DMSO，室溫避光振蕩孵育5 min后檢測OD值。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 收集各組16HBE 細胞加入預冷PBS 洗滌后棄上清，向細胞沉淀中加入500 μl 結(jié)合緩沖液，按照凋亡試劑盒說明書檢測細胞凋亡率。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測OIP5-AS1與miR-7-5p 的靶向關系 構(gòu)建含結(jié)合位點的野生型載體WT-OIP5-AS1 與含突變位點的突變型載體MUTOIP5-AS1，miR-NC、miR-7-5p mimics 分 別 與WTOIP5-AS1、MUT-OIP5-AS1 共轉(zhuǎn)染至16HBE 細胞后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞，檢測熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot 檢測Bcl-2、Bax 蛋白表達 提取各組16HBE 細胞總蛋白，SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后室溫封閉2 h，加入一抗稀釋液（1∶1 000） 4 ℃ 孵育過夜，加入二抗稀釋液（1∶2 000）室溫孵育1 h，應用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS 誘導的人支氣管上皮細胞中OIP5-AS1 與miR-7-5p 表達量 與Con 組相比，LPS 組OIP5-AS1表達水平升高（P＜0.05），miR-7-5p 表達水平降低 （P＜0.05，表1）。

表1 LPS 誘導 的16HBE 細胞中OIP5-AS1 與miR-7-5p 的表達（±s，n=9）Tab.1 Expressions of OIP5-AS1 and miR-7-5p in 16HBE cells induced by LPS （±s，n=9）

表1 LPS 誘導 的16HBE 細胞中OIP5-AS1 與miR-7-5p 的表達（±s，n=9）Tab.1 Expressions of OIP5-AS1 and miR-7-5p in 16HBE cells induced by LPS （±s，n=9）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05.

2.2 干擾OIP5-AS1 對LPS 誘導的人支氣管上皮細胞炎癥損傷的影響 與Con 組相比，LPS 組IL-6、 IL-8水平升高（P＜0.05）；與LPS+si-NC組相比，LPS+si-OIP5-AS1組IL-6、IL-8水平降低（P＜0.05，表2）。

表2 干擾OIP5-AS1對LPS誘導的16HBE細胞炎癥損傷的影響（±s，n=9，pg/ml）Tab.2 Effect of OIP5-AS1 interference on LPS-induced inflammatory injury of 16HBE cells（±s，n=9， pg/ml）

表2 干擾OIP5-AS1對LPS誘導的16HBE細胞炎癥損傷的影響（±s，n=9，pg/ml）Tab.2 Effect of OIP5-AS1 interference on LPS-induced inflammatory injury of 16HBE cells（±s，n=9， pg/ml）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with LPS+si-NC group， 2）P＜0.05.

2.3 干擾OIP5-AS1 對LPS 誘導的人支氣管上皮細胞增殖及凋亡的影響 與Con 組相比，LPS 組細胞活力降低，凋亡率升高，Bax 蛋白水平升高，Bcl-2 蛋白水平降低（P均＜0.05）；與LPS+si-NC 組相比，LPS+si-OIP5-AS1組細胞活力升高，凋亡率降低，Bax蛋白水平降低，Bcl-2 蛋白水平升高（P均＜0.05， 圖1、表3）。

表3 干擾OIP5-AS1對LPS誘導的16HBE細胞增殖及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of OIP5-AS1 interference on proliferation and apoptosis of 16HBE cells induced by LPS （±s，n=9）

表3 干擾OIP5-AS1對LPS誘導的16HBE細胞增殖及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of OIP5-AS1 interference on proliferation and apoptosis of 16HBE cells induced by LPS （±s，n=9）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with LPS+si-NC group， 2）P＜0.05.

圖1 干擾OIP5-AS1對LPS誘導的16HBE細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of interference with OIP5-AS1 on 16HBE cell apoptosis induced by LPS

2.4 OIP5-AS1 靶向調(diào)控miR-7-5p starBase 預測結(jié)果顯示OIP5-AS1與miR-7-5p存在結(jié)合位點（圖2）。miR-7-5p 過表達可明顯降低野生型載體WT-OIP5-AS1 的熒光素酶活性（P＜0.05），而對突變型載體MUT-OIP5-AS1 的熒光素酶活性無明顯影響（表4）。與si-NC 組相比，si-OIP5-AS1 組miR-7-5p 表達水平升高（P＜0.05，表5）。

表4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒ā纒，n=9）Tab.4 Double luciferase reporter gene experiment （±s， n=9）

表4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒ā纒，n=9）Tab.4 Double luciferase reporter gene experiment （±s， n=9）

Note：Compared with miR-NC group， 1）P＜0.05.

表5 OIP5-AS1靶向調(diào)控miR-7-5p表達（±s，n=9）Tab.5 OIP5-AS1 could target and regulate expression of miR-7-5p （±s，n=9）

表5 OIP5-AS1靶向調(diào)控miR-7-5p表達（±s，n=9）Tab.5 OIP5-AS1 could target and regulate expression of miR-7-5p （±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group， 1）P＜0.05.

圖2 OIP5-AS1序列中含有與miR-7-5p互補的核苷酸序列Fig.2 Sequence of OIP5-AS1 contains a nucleotide sequence complementary to miR-7-5p

2.5 miR-7-5p 過表達對LPS 誘導的人支氣管上皮細胞炎癥、增殖及凋亡的影響 與LPS+miR-NC 組相比，LPS+miR-7-5p 組IL-6、IL-8 水平降低，細胞活力升高，凋亡率降低，Bax 蛋白水平降低，Bcl-2 蛋白水平升高（P均＜0.05），見圖3、表6。

表6 miR-7-5p過表達對LPS誘導的16HBE細胞炎癥、增殖及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.6 Effects of miR-7-5p overexpression on LPS-induced inflammation， proliferation and apoptosis of 16HBE cells （±s，n=9）

表6 miR-7-5p過表達對LPS誘導的16HBE細胞炎癥、增殖及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.6 Effects of miR-7-5p overexpression on LPS-induced inflammation， proliferation and apoptosis of 16HBE cells （±s，n=9）

Note：Compared with LPS+miR-NC group， 1）P＜0.05.

圖3 miR-7-5p 過表達對LPS 誘導的16HBE 細胞凋亡的 影響Fig.3 Effect of miR-7-5p overexpression on LPS-induced apoptosis of 16HBE cells

2.6 抑制miR-7-5p 表達可逆轉(zhuǎn)干擾OIP5-AS1 對LPS 誘導的人支氣管上皮細胞炎癥、增殖及凋亡的影響 與LPS+si-OIP5-AS1+anti-miR-NC 組相比，LPS+si-OIP5-AS1+anti-miR-7-5p 組IL-6、IL-8 水平升高，細胞活力降低，凋亡率升高，Bax 蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低（P均＜0.05），見圖4、表7。

圖4 抑制miR-7-5p 表達可逆轉(zhuǎn)干擾OIP5-AS1 對LPS 誘導的16HBE細胞凋亡的影響Fig.4 Inhibition of miR-7-5p expression could reverse effect of interfering with OIP5-AS1 on LPS-induced apoptosis of 16HBE cells

表7 抑制miR-7-5p表達可逆轉(zhuǎn)干擾OIP5-AS1對LPS誘導的16HBE細胞炎癥、增殖及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.7 Inhibition of miR-7-5p expression could reverse effect of interfering with OIP5-AS1 on LPS-induced inflammation， proliferation and apoptosis of 16HBE cells （±s，n=9）

表7 抑制miR-7-5p表達可逆轉(zhuǎn)干擾OIP5-AS1對LPS誘導的16HBE細胞炎癥、增殖及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.7 Inhibition of miR-7-5p expression could reverse effect of interfering with OIP5-AS1 on LPS-induced inflammation， proliferation and apoptosis of 16HBE cells （±s，n=9）

Note：Compared with LPS+si-OIP5-AS1+anti-miR-NC group，1）P＜0.05.

3 討論

lncRNA 在支氣管上皮細胞損傷中表達異常并可發(fā)揮調(diào)控作用［6-8］。已有多篇文獻報道OIP5-AS1在ox-LDL 誘導的內(nèi)皮細胞損傷中發(fā)揮重要作用［9-11］。但OIP5-AS1 在LPS 誘導的支氣管上皮細胞損傷中的表達尚未可知。本研究結(jié)果顯示，LPS 誘導的16HBE 細胞中OIP5-AS1 表達水平升高。本研究發(fā)現(xiàn)LPS 誘導的16HBE 細胞中IL-6、IL-8 水平升高，與既往研究結(jié)果相似，提示支氣管上皮細胞損傷模型成功建立［12］。此外，干擾OIP5-AS1表達可明顯降低IL-6、IL-8 水平，提示干擾OIP5-AS1 表達可抑制LPS誘導的支氣管上皮細胞炎癥反應。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導的16HBE細胞活力降低，凋亡率升高，而干擾OIP5-AS1 表達可明顯增強LPS 誘導的16HBE 細胞活力，降低凋亡率，Bax 蛋白水平降低，Bcl-2 蛋白水平升高，提示干擾OIP5-AS1 表達可促進LPS誘導的16HBE細胞增殖而抑制細胞凋亡。

本研究證實OIP5-AS1 可靶向結(jié)合miR-7-5p，并負向調(diào)控miR-7-5p 活性。此外，研究發(fā)現(xiàn)LPS 誘導的16HBE 細胞中miR-7-5p 表達水平降低，干擾OIP5-AS1 表達可明顯提高miR-7-5p 的表達水平。lncRNA ANRIL 通過靶向miR-7-5p/SIRT1 軸而減輕缺氧誘導的心肌細胞損傷［13］。本研究結(jié)果顯示，miR-7-5p 過表達可明顯降低IL-6、IL-8 水平，細胞活力升高，凋亡率降低。同時本研究采用抑制miR-7-5p表達與干擾OIP5-AS1 表達聯(lián)合處理LPS 誘導的16HBE 細胞，結(jié)果顯示IL-6、IL-8 水平升高，細胞活力降低，凋亡率升高，提示抑制miR-7-5p 表達可逆轉(zhuǎn)干擾OIP5-AS1 對LPS 誘導的人支氣管上皮細胞炎癥、增殖及凋亡的作用。

綜上所述，支氣管上皮細胞損傷模型中OIP5-AS1表達水平升高，而miR-7-5p表達水平降低，干擾OIP5-AS1 表達可通過上調(diào)miR-7-5p 表達抑制LPS誘導的支氣管上皮細胞炎癥反應、凋亡及促進細胞增殖，從而減輕細胞損傷，OIP5-AS1 可能通過靶向調(diào)控miR-7-5p 參與哮喘等呼吸道疾病的發(fā)生及發(fā)展過程，但其具體作用機制尚需進一步探究。