張 彤, 劉 靜, 韓 敘, 童郁強, 魏亞偉

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學林學院，遼寧 沈陽 110866；2.遼寧遼河平原森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，遼寧 昌圖 112500）

我國遼西北屬農(nóng)牧交錯區(qū)，是防沙治沙工程的重點治理區(qū)，也是三北防護林的重要組成部分。近幾十年來,該地區(qū)營造了大面積人工林,在生態(tài)修復中起著重要的作用。樟子松(Pinus sylvestrisvar.Mongolica)耐寒性強，適應能力強，在土地貧瘠且較干旱的沙地也能生長良好,可以很好的起到防風固沙作用［1］，是遼西北地區(qū)的主要人工造林樹種之一，在生產(chǎn)生活以及該地區(qū)的森林資源利用上均起到了關鍵作用。然而該地區(qū)存在大量的放牧行為和人為破壞，對該地區(qū)的土壤產(chǎn)生了一定程度的影響。

土壤微生物參與森林生態(tài)系統(tǒng)的關鍵過程，包括有機質分解和養(yǎng)分循環(huán)、土壤結構形成和生物多樣性調節(jié)，可以保持土壤健康，穩(wěn)定土壤的生產(chǎn)力［2］。很多生物與非生物因素均會影響微生物的組成和多樣性，例如土壤濕度、土壤pH、有機碳含量、植被覆蓋、土地利用和生態(tài)系統(tǒng)干擾［3-4］。由于研究手段和方法有限，以往大多側重于微生物量的研究［5］。微生物多樣性可以有效提升微生物的功能性并保證生態(tài)系統(tǒng)可以穩(wěn)定發(fā)展［6］。近年來，隨著生物分析技術不斷的進步，除了物種組成上，從功能及遺傳的多樣性開展了一系列探究，對微生物多樣性研究進一步加深［7］。土壤中最敏感的是土壤微生物，生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變時可以較早的被其反映出來，因此可以指示土壤的質量［8］。國內外學者針對不同的土地管理方式對土壤微生物的影響開展了大量研究，研究發(fā)現(xiàn)，管理方式的不同會對微生物產(chǎn)生不同的影響［9-11］。例如，丁成翔等［9］針對青藏高原開展了一系列的研究，結果發(fā)現(xiàn)放牧使真菌擔子菌門的相對豐度顯著降低，對細菌群落組成無明顯影響；對多樣性指數(shù)的影響細菌比真菌更大。楊陽等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，放牧對細菌Simpson 指數(shù)影響顯著，但對真菌多樣性指數(shù)的影響并不明顯。微生物通過分解和轉化有機質來維持土壤養(yǎng)分的循環(huán)，同時土壤養(yǎng)分也會反作用于微生物。放牧中牲畜的啃食、排泄與人為的踐踏會使土壤養(yǎng)分發(fā)生變化。由于土壤系統(tǒng)的復雜性、草地類型的多樣性以及放牧方式的不同等，放牧對土壤養(yǎng)分的影響一直沒有統(tǒng)一的結論。高昌宇等［11］的研究表明，短期放牧不會顯著影響土壤養(yǎng)分的循環(huán)過程以及土壤微生物結構和功能。馬香云等［12］的研究顯示，放牧會在一定程度上增加土壤有機碳、氮含量，而祁正超等［13］的研究結果則表明，放牧會降低荒漠灌叢草地土壤有機碳和全氮含量。綜上所述，由于不同地區(qū)環(huán)境條件存在差異，放牧對土壤養(yǎng)分的影響也不同。以往各地區(qū)對于土壤微生物及養(yǎng)分的研究多為草地，針對沙地人工林的研究較為少見。因此，深入探討放牧對沙地樟子松人工林土壤養(yǎng)分及土壤微生物的影響，以便指導人們因地制宜地管理該地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)。

遼西北地區(qū)是三北防護林的重要組成部分，然而近年來該地區(qū)人工林中放牧活動逐漸增多，給人工林的發(fā)展造成了一定影響，因此本研究選取遼西北的沙地樟子松人工林為研究對象，探討放牧和圍封下土壤微生物群落結構和多樣性以及土壤養(yǎng)分的差異，以期為該地區(qū)樟子松人工林的可持續(xù)管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗樣地設置在遼寧遼河平原森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站（43°23′23″～43°3′23″N，123°38′52″～124°6′20″E）。研究區(qū)域屬溫帶半濕潤半干旱大陸性季風氣候，最高氣溫35.6 ℃，最低氣溫-32 ℃，日平均氣溫6.4 ℃，10 ℃以上年積溫3218 ℃。年降水量450～550 mm，降水大多集中在7—8月，年均蒸發(fā)量1843 mm，是降水量的3～4倍，相對濕度59%。早霜期在9月底或10月初，晚霜期在4月中下旬，無霜期145～150 d。土壤pH值在6.0～7.0之間，多為風沙土。植被群落以樟子松（Pinus sylvestrisvar.Mongolica）和楊樹（Populus×canadensis）防風固沙林為主，其中樟子松人工林面積最大，已達5486 hm2。該地區(qū)的原生植被為少量的草本和木本，如糙隱子草（Cleistogenes squarrosa）、狗尾巴草（Setaria viridis）、紫 穗 槐（Amorpha fruticosa） 和 黃 柳（Salix gordejevii）等。

1.2 土壤樣品的采集與處理

于2014年選取植被長勢均勻、立地條件基本一致的樟子松人工林作為試驗樣地（表1），在圍封(CK)樣地邊界處設置圍欄，使圍封樣地內樟子松在沒有任何干擾的情況下生長；放牧樣地則不設置任何圍欄，允許放牧行為和一切人為干擾。在放牧（G）和圍封(CK)的樣地內各設置3 塊20 m×20 m 的樣方，各樣方之間間隔≥50 m。2021 年8 月在放牧和圍封各3 個樣方內利用土鉆對表層（0～10 cm）土壤進行取樣，每樣方設置6～8個采樣點，用四分法混合后分成2份，分別裝入無菌自封袋中，做好標記后密封帶回實驗室。用于測定土壤養(yǎng)分的樣品在實驗室內挑出細根和雜質，風干后研碎，過2 mm 網(wǎng)篩。用于測定微生物群落的土壤樣品，去除細根，碎石等雜質，過80 或100 目篩，放入2 mL 離心管于-80 ℃冰箱冷凍保存。

表1 樣地基本概況Tab.1 Basic profile of the plot

1.3 測定方法

土壤有機碳含量采用重鉻酸鉀外加熱法測定；土壤有效磷含量使用紫外分光光度計測定；土壤中全氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和全磷含量使用AA3 流動分析儀測定。土壤微生物群落通過illumina MiSeq 高通量測序技術進行測定。真菌的測序區(qū)為ITS rRNA 的V1 區(qū)，正向引物：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG，反向引物：GCTGCGTTCTTCATCGATGC；細菌的測序區(qū)為16s rRNA的V3+V4區(qū)，正向引物：ACTCCTACGGGAGGCAGCA，反 向 引 物：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。真菌和細菌使用同一份土壤樣品進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

土壤養(yǎng)分數(shù)據(jù)使用Excel 2013 進行處理，使用SPSS 22.0 進行獨立樣本T檢驗分析，數(shù)據(jù)為平均值±標準差。采用Bray距離來分析放牧與圍封土壤間群落結構的差異，并通過非度量多維尺度(NMDS)進行可視化。采用Canoco5 中的冗余分析（RDA)來研究土壤養(yǎng)分與真菌和細菌群落多樣性指數(shù)的相關性。

2 結果與分析

2.1 放牧對土壤微生物群落的影響

2.1.1 放牧與圍封土壤微生物的OTU數(shù) 表2對平均豐度大于1的所有OTUs進行了韋恩分析，可以看出，對于土壤真菌圍封樣地獲得的OTUs有1451條，放牧樣地獲得929 條，放牧與圍封共有的OTUs 有585條。土壤細菌圍封樣地獲得14388條，放牧樣地獲得10597 條，放牧與圍封共有4272 條。2 種處理的相似度為17.1%～24.6%。放牧使真菌的OTUs 和細菌的OTUs均呈降低的趨勢。

表2 放牧對土壤微生物OTUs的影響Tab.2 Effects of grazing on soil microbial OTUs

2.1.2 放牧與圍封土壤微生物的稀疏曲線 稀疏曲線可以反映出在當前測序深度下各樣本內的微生物種類組成。通過真菌和細菌的稀疏曲線（圖1）可以看出，相同的測序深度下，OTU 數(shù)均為放牧小于圍封，說明放牧的微生物多樣性低于圍封。在本研究中當序列數(shù)量達到20000后各稀疏曲線均逐漸平緩，也說明測序數(shù)量充足，取樣科學，可以較準確地反映真菌和細菌群落的組成。

圖1 稀疏曲線Fig.1 Sparse curve

2.1.3 放牧與圍封土壤微生物的各分類水平類群分布 從表3可以看出，在各個分類水平下，圍封和放牧真菌的類群數(shù)均為放牧小于圍封，并且圍封與放牧類群數(shù)均在屬水平最大，分別為116.4和88.8。對于細菌而言，在各水平下仍為放牧小于圍封，圍封與放牧類群數(shù)仍然在屬水平最大，分別為371.6 和332.6，不同的是細菌屬水平的類群數(shù)放牧顯著低于圍封（P＜0.05）。

表3 各分類水平微生物類群數(shù)統(tǒng)計Tab.3 Statistical of microbial groups at different taxonomic levels

2.1.4 放牧與圍封土壤微生物的門水平類群分布 從圖2 可以看出，將無法識別的類群歸為其他（9.97%～11.47%），放牧和圍封樣地各樣本中可讀取的真菌門水平類群共有10 個，分別是子囊菌門Ascomycota(37.34%～47.05%)、擔子菌門Basidiomycota（28.21% ～44.99%）、被孢霉門Mortierellomycota（5.88%～14.23%）、球囊菌門Glomeromycota（0.1%～0.38%）、壺菌門Chytridiomycota（0.05%～0.1%）、毛霉菌門Mucoromycota（0.05%～0.05%）、Calcarisporiellomycota（0.03%～0.04%）、油壺菌門Olpidiomycota（0.01%～0.02%）、梳霉門Kickxellomycota（0.01%～0.01%）、羅茲菌門Rozellomycota（0.00%～0.01%）。其中，優(yōu)勢菌門為子囊菌門、擔子菌門和被孢菌門，3 個類群占比超過了80%。由于放牧，子囊菌門和被孢菌門的相對豐度升高，但不顯著（P＞0.05），而擔子菌門的相對豐度顯著降低（P＜0.05)。

圖2 放牧和圍封樣地土壤微生物門水平類群分布Fig.2 Distribution of soil microbial phyla horizontal groups in grazing and enclosed plots

無法識別的類群其他占1.99%～2.57%?？勺x取的細菌門水平類群共10個，分別是變形菌門Proteobacteria（33.21%～35.51%）、放線菌門Actinobacteria（30.44%～34.74%）、酸桿菌門Acidobacteri（12.07%～12.23%）、綠彎菌門Chloroflexi（6.25%～6.65%）、厚壁菌門Firmicutes（3.13%～6.30%）、芽單胞菌門Gemmatimonadetes（2.46%～2.76%）、擬桿菌門Bacteroidetes（0.98%～1.86%）、髕骨細菌門Patescibacteria（1.07%～1.59%）、疣微菌門Verrucomicrobia（1.11%～1.43%）、棒狀桿菌門Rokubacteria（0.79%～0.87%）。其中，優(yōu)勢菌門為變形菌門、放線菌門和酸桿菌門，相對豐度超過80%。放牧相比于圍封，變形菌門和酸桿菌門的相對豐度降低，放線菌門的相對豐度升高，且均不顯著（P＞0.05）。

2.1.5 放牧與圍封土壤微生物的非度量多維尺度分析 圖3 是基于Bray 距離的非度量多維度尺度（NMDS)分析，結果表明沙地樟子松人工林放牧和圍封樣地樣本間距離較遠，說明放牧和圍封樣地土壤真菌和細菌群落結構存在差異（真菌：stress=0.065；細菌：stress=0.0707）。

圖3 土壤微生物群落非度量多維尺度分析Fig.3 Non-metric multidimensional scaling analysis of soil microbial communities

2.1.6 放牧與圍封土壤微生物的多樣性指數(shù) 由表4 可以看出，放牧之后沙地樟子松林土壤真菌的Chao1指數(shù)、Shannon 指數(shù)呈減少趨勢，Simpson 指數(shù)呈增加趨勢，但未形成顯著差異（P＞0.05）。放牧極顯著降低了土壤細菌的Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)（P＜0.01），Simpson指數(shù)同樣是放牧小于圍封，但差異不顯著（P＞0.05）。

表4 放牧對沙地樟子松土壤微生物多樣性的影響Tab.4 Effects of grazing on soil microbial diversity of Pinus sylvestris var.Mongolica in sandy land

2.2 放牧對土壤養(yǎng)分的影響

2.2.1 放牧對土壤養(yǎng)分顯著性分析 從表5 可以看出，放牧和圍封樣地之間土壤養(yǎng)分的差異，放牧土壤中全磷的含量顯著低于圍封（P＜0.05）；土壤中的有機碳、全氮含量等均為放牧低于圍封（P＞0.05）；銨態(tài)氮、硝態(tài)氮以及有效磷含量均為放牧高于圍封樣地，但沒有顯著差異（P＞0.05）。

表5 放牧對土壤養(yǎng)分的影響Tab.5 Effects of grazing on soil nutrients

2.2.2 土壤養(yǎng)分間的相關性分析 表6 對土壤養(yǎng)分之間進行了相關性分析，可以看出有機碳含量與全氮、全磷含量呈顯著正相關（P＜0.05）。硝態(tài)氮與有效磷呈極顯著正相關（P＜0.01），其余養(yǎng)分之間相關性并不顯著（P＞0.05）。

表6 土壤養(yǎng)分相關性分析Tab.6 Correlation analysis of soil nutrients

2.3 放牧與圍封土壤微生物多樣性與土壤養(yǎng)分的冗余分析

真菌多樣性指數(shù)與土壤養(yǎng)分的RDA 排序結果如圖4a 所示，兩軸的累計貢獻率為69.26%，表明真菌的多樣性指數(shù)和土壤養(yǎng)分顯著相關，土壤有機碳（r=-0.889）在第一軸相關性較大，第一軸的貢獻率為62.13%。

細菌多樣性指數(shù)與土壤養(yǎng)分的RDA 排序結果如圖4b 所示，兩軸的累計貢獻率為84.34%，表明細菌的多樣性指數(shù)和土壤養(yǎng)分顯著相關，土壤硝態(tài)氮（r=0.815）、土壤全磷（r=-0.89）、土壤有效磷（r=0.849）、土壤有機碳（r=-0.838）、土壤全氮（r=-0.863）在第一軸相關性較大，第一軸的貢獻率為74.81%。

圖4 微生物多樣性指數(shù)與土壤養(yǎng)分的RDA分析Fig.4 RDA analysis of microbial diversity index and soil nutrients

3 討論

3.1 放牧對土壤微生物群落的影響

放牧行為會對土壤微生物群落造成不同程度的直接影響和間接影響［14］。土壤微生物群落結構的變化強烈影響著生態(tài)系統(tǒng)功能［15-16］。微生物多樣性可以反映群落組成的差異以及均勻性，同時也可以反映出土壤微生物群落功能的多樣性［17］。本研究中，2 種處理的OTUs 數(shù)均為細菌高于真菌，微生物的相似度為17.1%～24.6%，并且真菌與細菌的OTUs數(shù)均為放牧少于圍封，這與楊陽等［10］的研究結果一致。在放牧與圍封樣地中土壤真菌的優(yōu)勢菌門為子囊菌門、擔子菌門和被孢菌門；細菌的優(yōu)勢菌門為變形菌門、放線菌門和酸桿菌門。其中,真菌擔子菌門的相對豐度由于放牧顯著降低，對真菌和細菌的其他門類群的影響均不明顯，擔子菌門對于環(huán)境變化比較敏銳，長期的雙核分裂狀態(tài)導致其生長緩慢［18］，因此擔子菌門可以指示環(huán)境的干擾，擔子菌門的主要功能是分解植物木質化殘渣［19］，放牧行為導致植物及殘渣減少，因而導致?lián)泳T相對豐度降低，這與丁成翔等［9］的研究結果一致。放牧極顯著降低了細菌的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)，增加了Simpson 指數(shù)；對真菌群落多樣性無明顯影響?？赡苁怯捎诜拍潦刮⑸镂锓N數(shù)減少，多樣性降低，生物競爭相對弱化，從而提高了均勻度。Wang等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在海拔3200 m，放牧的微生物多樣性指數(shù)均低于圍封，這與本研究結果相似。尹亞麗等［21］的研究發(fā)現(xiàn)，放牧對細菌多樣性的影響不明顯，但真菌Simpson和Shannon指數(shù)顯著降低。而本研究結果顯示，放牧對真菌群落的多樣性影響有限，而土壤細菌對放牧的響應更加顯著，可能由諸多原因造成，例如海拔、氣候、土地類型和植被組成等均可能引起多樣性發(fā)生變化［22-23］。

3.2 放牧對土壤養(yǎng)分的影響

放牧是人工林管理的重要影響因子，影響著該地區(qū)植被狀況、物質循環(huán)以及養(yǎng)分的儲存；放牧種類、放牧強度、放牧時間等均會對微生物群落和土壤養(yǎng)分產(chǎn)生影響［24］。土壤有機質可以評價土壤肥力，有助于各生物的生長發(fā)育。氣候、管理方式、植被和土壤等因素均會影響有機質的轉化［25］。本試驗研究了2 種處理方式間土壤養(yǎng)分的差異，由于放牧，土壤全磷含量顯著降低，說明放牧不利于積累土壤中全磷含量。放牧通過改變凋落物數(shù)量和質量導致輸入的磷含量減少，牧畜采食影響植被蓋度和高度，進而改變土壤風蝕及水蝕過程，土壤中磷元素更易流失。有機碳和全氮含量在放牧后有所降低，但無明顯差異，這與高昌宇等［11］的研究結果一致。由于動物啃食和踩踏，放牧地的初級生產(chǎn)力以及枯落物量降低，減少了輸入地下的有機物，導致土壤中有機質含量降低。但土壤有機碳和全氮并沒有顯著性變化，說明放牧對土壤養(yǎng)分的影響長期且遲緩。本實驗中放牧后銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量呈現(xiàn)增加趨勢，這與楊陽等［10］的研究結果相同，速效養(yǎng)分的增加或許是由于放牧加大了土壤表層的緊實度，且牧畜的糞便尿液等的輸入，在一定程度上增加了表層土壤的速效養(yǎng)分。

放牧過程中動物啃食、踩踏行為和糞便均對土壤養(yǎng)分產(chǎn)生影響，土壤中的微生物群落會隨著土壤狀況的改變產(chǎn)生變化，土壤微生物經(jīng)過腐殖化和礦化作用控制著有機質的分解并且調節(jié)土壤養(yǎng)分的可用性［26-28］，二者相互影響。本研究表明，土壤養(yǎng)分解釋了69.26%和84.34%的真菌和細菌多樣性的變化，說明土壤微生物群落多樣性與養(yǎng)分之間相關性很大。真菌Chao1 指數(shù)與有機碳含量呈顯著負相關，凋落物和根系分泌物等是真菌利用的主要基質，也是有機碳分解和積累的主要來源［29］，真菌會通過消耗有機碳來滿足自身的生長需求。細菌Shannon指數(shù)與硝態(tài)氮、有效磷呈顯著正相關，或許是因為牲畜的頻繁踩踏導致土壤更加緊實，氧氣含量也更低，減緩了細菌對速效成分的分解速率［30］。近年來由于生物技術不斷進步，生物多樣性的研究日益豐富，而微生物量的測定技術已較為成熟，大量學者已經(jīng)采用了該技術開展研究［4,7］，本研究后續(xù)應結合微生物量等指標繼續(xù)研究放牧對土壤微生物的影響，為該地區(qū)樟子松人工林的可持續(xù)管理提供科學依據(jù)。

4 結論

放牧極顯著降低了細菌的Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)（P＜0.01），對真菌群落多樣性無明顯影響（P＞0.05）；從土壤微生物群落組成上來看，真菌分類學門水平中擔子菌門比例放牧顯著低于圍封（P＜0.05），但對細菌門水平并未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。對于土壤養(yǎng)分而言，放牧顯著降低了全磷含量（P＜0.05），也降低了土壤有機碳和全氮含量，但無顯著差異（P＞0.05）?？梢?，沙地樟子松林的放牧行為對土壤養(yǎng)分及土壤微生物均有不同程度的負面影響，所以該地區(qū)應適度減少放牧行為，緩解土地壓力，以保障樟子松人工林的可持續(xù)利用。