劉士力，練青平，賈永義，遲美麗，李 飛，姜建湖，劉一諾，鄭建波，程 順，顧志敏，*

(1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州 313001； 2.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

馬口魚(Opsariichthysbidens)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)，鯉科(Cyprinidae)，馬口魚屬，因其上頜兩側(cè)邊緣各有一個(gè)缺口，正好與下頜的突起相吻合，形似馬口，故名“馬口魚”，在中國南北各大水系、水庫、溪流皆有分布，多生活于溪流及水庫等清澈水體中，尤其喜在水流較急的淺灘、底質(zhì)為砂石的小溪和江河支流中集群生活，以小魚、小蝦、水生昆蟲等為食[1-2]。馬口魚為肉食性經(jīng)濟(jì)魚類，肉質(zhì)鮮美，深受山區(qū)廣大消費(fèi)者喜愛。金丹璐等[3]對馬口魚的胚胎發(fā)育和仔稚魚生長進(jìn)行了觀察，馬口魚繁殖技術(shù)已獲得突破，在人工養(yǎng)殖條件下投喂配合飼料生長良好。目前，在南方山區(qū)已經(jīng)形成成熟的馬口魚養(yǎng)殖業(yè)，馬口魚已成為山區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)魚類之一，市場前景廣闊[4-5]。

線粒體DNA(mitochondrial DNA， mtDNA)標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于水生動(dòng)物的遺傳多樣性分析[6-9]。Zardoya等[10]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素b (cytochrome b，Cytb)的進(jìn)化速率適中，替換、缺失和插入等突變能夠穩(wěn)定持續(xù)遺傳，可適用于種間、種內(nèi)的遺傳分析。馬口魚具有較高的營養(yǎng)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值，通過線粒體Cytb基因序列開展遺傳結(jié)構(gòu)研究，對于種群的保護(hù)與良種選育具有重要意義。高嘉昕等[11]基于Cytb基因序列對長江上游干流及支流的13個(gè)地理種群的大鱗馬口魚(O.macrolepis)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)所有單倍型可分成2個(gè)譜系，表現(xiàn)出東-西方向的地理差異。Perdice等[12]基于Cytb基因?qū)χ榻?、長江和海河水系的馬口魚系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)了5個(gè)譜系，這些譜系間的遺傳差異已達(dá)到種間水平。Li等[13]基于Cytb基因序列分歧發(fā)現(xiàn)中國馬口魚以南嶺為界分為2大譜系，認(rèn)為這2個(gè)譜系可能對應(yīng)2個(gè)不同的種。鄧艷等[14]通過Cytb序列對伊洛河馬口魚遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)伊洛河馬口魚存在2個(gè)分支，推測2個(gè)分支間線粒體DNA的遺傳差異可能源自于祖先種群或者種間雜交。錢塘江和甌江是浙江省最大的2條河流，暫未見對其馬口魚遺傳多樣性的研究，人工繁殖對于馬口魚遺傳多樣性的影響也未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將浙江甌江(OJ)和錢塘江(QTJ) 2個(gè)野生群體及八里店(BL)養(yǎng)殖群體的線粒體細(xì)胞色素b(Cytb)基因全長進(jìn)行擴(kuò)增，并與GenBank中國內(nèi)主要河流的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，探明浙江這3個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)，為馬口魚的種質(zhì)資源保護(hù)、良種選育與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)采用浙江省野生群體2個(gè)，養(yǎng)殖群體1個(gè)。其中野生群體為2017年10月采自甌江(麗水段)和錢塘江(衢州段)，野生群體各取33尾樣本。養(yǎng)殖群體32尾，于2021年6月采自浙江省淡水水產(chǎn)研究所八里店綜合試驗(yàn)基地(湖州)，其親本為2017年自錢塘江(衢州段)引進(jìn)經(jīng)3次傳代留種的后代。剪取適量尾鰭組織，采用無水乙醇保存，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中。

主要試劑：PCR試劑購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；用于DNA提取的試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用苯酚-氯仿法提取樣本DNA。用1%瓊脂糖凝膠檢測所獲DNA的完整性。將檢測合格的DNA溶液于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 線粒體COI基因片段的擴(kuò)增與序列測定

根據(jù)GenBank公布的馬口魚線粒體基因及其側(cè)翼DNA序列(登錄號：KX925976)應(yīng)用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)Cytb擴(kuò)增和測序的引物Cyt b-F和Cyt b-R。Cyt b-F：5′-TTAACCGAGACCAATGACTT-3′；Cyt b-R：5′-TAGGAACCAGATACCAGGAA-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[15]。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物用 1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測合格后送生工生物工程(上海)股份有限公司采用上下游引物進(jìn)行雙向測序。

1.2.3 序列分析

用于比較分析的序列來自Perdices等[12]的138條序列(GenBank登錄號：AY646512.1-AY646649.1)和Li等[13]的98條序列(GenBank登錄號：FJ601919.1-FJ602016.1)。通過BioEdit 7.0軟件對序列進(jìn)行比對分析并對照原始序列峰圖進(jìn)行人工校對。應(yīng)用Mega 6.0軟件計(jì)算堿基含量，并采用鄰接法基于Kimura’s 2-Parameter模型建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。運(yùn)用DnaSP 5.0軟件計(jì)算單倍型數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)(h)、變異位點(diǎn)數(shù)目和核苷酸多樣性指數(shù)(π)。使用Arlequin 3.1中的分子方差分析(AMOVA)法計(jì)算固定指數(shù)(Fst)，并進(jìn)行中性檢驗(yàn)，計(jì)算Tajima’s D和Fu’s FS參數(shù)，以此推測群體的歷史演化。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬口魚Cyt b基因堿基組成與變異分析

本實(shí)驗(yàn)對浙江省馬口魚3個(gè)群體98個(gè)樣本的Cytb基因進(jìn)行了擴(kuò)增和測序。共獲得了98條1 590 bp的同源序列，提交GenBank后獲得登錄序列號為：MZ507432-MZ507529。選擇其中1 140 bp編碼Cytb的序列用于下一步分析。將這98條序列與GenBank中獲得的236條序列進(jìn)行綜合分析。結(jié)果顯示，在1 045個(gè)位點(diǎn)(除去部分序列存在的缺失堿基)中存在變異位點(diǎn)288個(gè)，簡約信息位點(diǎn)254個(gè)，分別占分析位點(diǎn)的27.6%和24.3%。平均轉(zhuǎn)顛換比值(TS/TV)為12。4種堿基在334條序列中平均含量為A (24.2%)、G (16.7%)、T (29.7%)和C(29.4%)，其中G的含量最低，A+T含量為53.9%，明顯高于C+G含量。浙江的3個(gè)群體堿基組成差異不大(表1)。

表1 馬口魚3個(gè)群體Cyt b基因序列的堿基組成

與GenBank中的序列進(jìn)行綜合分析。在334個(gè)個(gè)體發(fā)現(xiàn)了136種單倍型，其中33個(gè)甌江樣本僅有1種單倍型，33個(gè)錢塘江樣本具有10種單倍型，八里店群體具有6種單倍型。八里店群體和錢塘江群體共享3個(gè)單倍型(表2)。錢塘江群體與湖南的澧水和沅江樣本具有共享單倍型(圖1)。

OJ， 甌江； QT， 錢塘江； BL， 八里店； LS， 澧水； YJ， 沅江； ZS， 資水； LJ， 漓江； LIU， 柳江； MJ， 閩江； HH， 淮河； LC， 瀾滄江；NP， 南盤江； YE， 黃河。OJ， Oujiang； QT， Qiantang River； BL， Balidian； LS， Lishui River； YJ， Yuanjiang River； ZS， Zishui River； LJ， Lijiang River； LIU， Liujiang River； MJ， Minjiang River； HH， Huaihe River； LC， Lancang River； NP， Nanpan River； YE， Yellow River.圖1 基于馬口魚Cyt b單倍型構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 NJ molecular dendrogram based on Cyt b haplotype of O. bidens

表2 馬口魚3個(gè)群體Cyt b基因序列的單倍型分布情況

2.2 馬口魚Cyt b基因遺傳結(jié)構(gòu)分析

使用DnaSP(version 5.0)軟件計(jì)算馬口魚3個(gè)群體的遺傳多樣性參數(shù)(表3)，結(jié)果顯示，3個(gè)群體的單倍型(0～0.716)和核苷酸(0～0.016 16)的多樣性程度具有明顯分化。甌江群體僅有1種單倍型，單倍型和核苷酸多樣性為0。錢塘江群體的單倍型數(shù)和多樣性高于八里店群體，表明馬口魚3個(gè)群體具有不同的遺傳多樣性。

表3 馬口魚群體Cyt b基因序列的遺傳多樣性參數(shù)

3個(gè)馬口魚群體線粒體DNACytb基因序列的遺傳差異AMOVA分析結(jié)果表明，群體間的Fst=0.550 55 (P<0.01)，整個(gè)遺傳變異中群體間占55.06%，其余的遺傳變異來自于群體內(nèi)(44.94%)，總體上，群體間具有較高程度的遺傳分化(表4)。

表4 馬口魚群體線粒體Cyt b基因序列分子方差分析

2.3 各群體遺傳距離分析

通過Mega 6.0軟件計(jì)算各地理種群間遺傳距離，所得結(jié)果見表5。由表5可知，各群體間遺傳距離為0.012 072～0.027 505，遺傳距離差距較大。其中甌江與八里店群體的遺傳距離最近，甌江與錢塘江群體的遺傳距離最遠(yuǎn)。運(yùn)用Arlequin計(jì)算各群體間的Fst在0.402 95～0.696 61。3個(gè)群體之間的遺傳分化系數(shù)都大于0.25，其中甌江群體與另外2個(gè)群體的遺傳分化系數(shù)均在0.5以上。

表5 馬口魚3個(gè)群體間的遺傳距離(對角線下方)和固定指數(shù)(對角線上方)

基于馬口魚浙江省3個(gè)群體線粒體Cytb基因序列分析獲得了14種單倍型，加上選取GenBank中具有代表性的7種單倍型，對其采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，顯示錢塘江群體大致分為3個(gè)分支。其中第1分支與長江水系湖南省采集的樣品較為接近，63.64%的錢塘江個(gè)體屬于這1支，另有1分支與珠江水系廣西漓江采集的樣品聚為一支；剩下1大支包含全部的甌江群體和剩余的八里店、錢塘江個(gè)體，這個(gè)分支是以前的調(diào)查中沒有發(fā)現(xiàn)的單倍型分支。這說明錢塘江群體的祖先來源有一定的復(fù)雜性。本實(shí)驗(yàn)為研究浙江省馬口魚的來源和種質(zhì)資源提供了第一手素材，具有一定的指導(dǎo)意義。

2.4 群體動(dòng)態(tài)分析

群體中性檢驗(yàn)顯示，甌江群體的Tajima’s D和Fu’s Fs值為0，錢塘江和八里店群體的Tajima’s D和Fu’s Fs值為正值，3個(gè)群體Tajima’s D和Fu’s Fs檢驗(yàn)均不顯著(P>0.01)。由于甌江群體33個(gè)樣本為單一單倍型，不存在多態(tài)性，不能進(jìn)行核苷酸不配對分布分析。對錢塘江和八里店群體進(jìn)行中性檢驗(yàn)和核苷酸不配對分布(mismatch distribution)分析的結(jié)果顯示，馬口魚錢塘江和八里店群體核苷酸不配對分布呈現(xiàn)多峰型(圖2)，在中性檢驗(yàn)中Tajima’s D值均為正值，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果不顯著(P>0.05)，表明甌江和八里店群體沒有經(jīng)歷群體擴(kuò)張，群體大小保持相對穩(wěn)定。

A，錢塘江；B，八里店。A， Qiantang River； B， Balidian.圖2 馬口魚核苷酸錯(cuò)配分布圖Fig.2 The nucleotide mismatch distribution of O. bidens

3 討論

Cytb基因作為線粒體中重要的蛋白質(zhì)編碼基因，進(jìn)化速率適中，被廣泛應(yīng)用于遺傳結(jié)構(gòu)分析中。對移植到北方松嫩平原區(qū)湖泊、水庫的大銀魚(Protosalanxhyalocranius)群體的采用Cytb分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，大銀魚93.81%的遺傳差異來自群體內(nèi)，6.19%來自群體間。但群體間遺傳分化均達(dá)到顯著水平或極顯著水平，這和各水體不同批次移植、投放大銀魚受精卵的特征是一致的[16]。隋宥珍等[17]采用Cytb序列分析了黃海、東海和南?？谖r蛄(Oratosquillaoratoria)群體間的遺傳變異，結(jié)果表明，可明顯分為3個(gè)譜系，其單倍型類群組成在空間上的分布頻率存在顯著差異。Perdices等[12]對采自長江、珠江和海河3個(gè)水系的28個(gè)馬口魚群體進(jìn)行了研究，認(rèn)為這些樣本包含5個(gè)譜系，在這5個(gè)譜系間存在高度的遺傳分化，92%的遺傳分化是由于譜系的不同，不同水系間較多的不共享單倍型數(shù)量和中等水平的核苷酸多樣性表明，它們可能是獨(dú)立進(jìn)化的，最終得出中國的馬口魚可以分為5個(gè)種的結(jié)論。Li等[13]結(jié)合Perdices等[12]的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，認(rèn)為馬口魚Cytb由4個(gè)類群組成，隸屬于2個(gè)分支，可分為2個(gè)種。本實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充了中國東部甌江和錢塘江的樣品情況，其中部分樣品可以構(gòu)成一個(gè)新的類群。

錢塘江是浙江省最大的河流，雖然不屬于長江的支流，但具有一些河道相通。因此錢塘江和長江水系湖南省采集的群體具有共享單倍型。甌江位于浙江南部，為浙江省第二大江，距離長江有一定距離。其僅包含有1種單倍型。從現(xiàn)有的數(shù)據(jù)看，這個(gè)單倍型是甌江獨(dú)有的，但仍待進(jìn)一步采集樣品進(jìn)行驗(yàn)證。甌江這個(gè)單倍型先和錢塘江的部分單倍型聚在一起，然后和淮河、黃河中的部分單倍型聚集在一起。根據(jù)Grant等[18]的標(biāo)準(zhǔn)，錢塘江群體符合魚類第4種單倍型與核苷酸多樣性組合，即高h(yuǎn)和高π類型。造成這個(gè)結(jié)果的原因?yàn)槿后w可能由一個(gè)大而穩(wěn)定的群體經(jīng)過長時(shí)間演化所產(chǎn)生或由多個(gè)不同系群的群體二次接觸所形成。通過本文的單倍型進(jìn)化樹分析，符合多個(gè)不同系群的群體二次混合形成。甌江群體符合魚類第1種單倍型與核苷酸多樣性組合，即低h和低π類型[18]。該群體最近遇到瓶頸效應(yīng)或者由少量母系個(gè)體繁殖而來。八里店人工繁育群體種源來自于錢塘江，雖然由于馬口魚懷卵量較少，人工繁殖采用的親本數(shù)量較多，但經(jīng)過數(shù)代人工繁殖，單倍型數(shù)、單倍型多樣性及核苷酸多樣性都有所降低。需要在避免人工養(yǎng)殖群體逃逸對野生資源的影響的同時(shí)，制定科學(xué)的繁育策略預(yù)防群體遺傳多樣性降低對養(yǎng)殖造成的不利影響。

衡量種群多態(tài)性的重要指標(biāo)包括種群間的遺傳距離以及遺傳分化指數(shù)。Shaklee等[19]提出魚類在屬、種和種群三級水平上的遺傳距離分別為0.90、0.30及0.05的分類依據(jù)。本文中的浙江3個(gè)群體的分化屬于種群的水平。根據(jù)Wright[20]采用固定指數(shù)(Fst)作為衡量群體間遺傳分化程度的標(biāo)準(zhǔn)，3個(gè)群體屬于極高度分化。本文中，種群間的遺傳距離分析與Fst的分析結(jié)果并不完全一致。其中八里店與錢塘江群體的遺傳分化系數(shù)最低，但八里店群體與甌江的遺傳距離更近一些。這可能是由于八里店樣本中81.3%的個(gè)體處和甌江同一分支中，但八里店群體僅有27.3%的樣本處于這一分支中。在此前的研究中，不同水系沒有共享單倍型。這不僅和地理距離較遠(yuǎn)有關(guān)系，也和采集的樣本數(shù)量和采樣點(diǎn)的密度有關(guān)。錢塘江除了具有和長江、珠江水系共享的單倍型外，自身還具有特有的單倍型。隨著數(shù)據(jù)庫中馬口魚Cytb基因序列數(shù)量的逐漸增多，Cytb基因已成為研究馬口魚群體遺傳多樣性的重要分子標(biāo)記。本研究獲得的錢塘江和甌江野生群體的Cytb數(shù)據(jù)是馬口魚種質(zhì)數(shù)據(jù)的重要補(bǔ)充，對八里店養(yǎng)殖群體的分析表明其遺傳多樣性有所降低。研究結(jié)果為浙江省馬口魚的種質(zhì)資源分類評估、種群關(guān)系研究及長期穩(wěn)定保護(hù)和利用提供了重要參考依據(jù)。