鄭 冉，呂 丹，武清貴，邸曉紅，朱通通，邱冠杰，羅紅兵，2，*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128； 2.湖南省玉米工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128)

不育化制種是當(dāng)前玉米制種的一種重要方式[1]。細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)是由細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)基因共同控制的雄性不育，可實現(xiàn)不育系、保持系和恢復(fù)系的三系配套。玉米CMS分為T型、C型和S型3類，其中C型不育系敗育較徹底，育性表現(xiàn)穩(wěn)定，在玉米不育化制種中具有巨大的潛力[2]。

玉米CMS的發(fā)生過程存在異常的生理代謝，對其生理生化特性進行研究可將玉米遺傳特性與個體表型聯(lián)系起來，可為揭示玉米雄性不育的發(fā)生機理提供參考[3]。營養(yǎng)物質(zhì)的虧缺被認(rèn)為是CMS產(chǎn)生的一個重要原因[4]。研究發(fā)現(xiàn)，玉米雄性不育材料中的可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸等物質(zhì)的含量少、代謝水平低[5-8]。株系的正常發(fā)育都會伴隨著營養(yǎng)物質(zhì)的積累與合成，因此，不育材料中營養(yǎng)物質(zhì)含量的降低，必然會造成代謝紊亂，從而導(dǎo)致不育。活性氧(ROS)的積累也被認(rèn)為是CMS產(chǎn)生的原因之一，當(dāng)ROS過多時，會促使丙二醛(MDA)積累，從而引起相關(guān)組織的生理生化紊亂[9-11]。段俊等[12]研究表明，玉米不育系葉片和雄穗中的ROS含量高于保持系；鄧杰[5]對玉米細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的研究發(fā)現(xiàn)，不育系對OH·的清除速率和MDA含量高于保持系；張勤[7]試驗發(fā)現(xiàn)，玉米不育系葉片中MDA、H2O2和O2-含量均高于同期的可育系。過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)是活性氧清除系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)中重要的酶。研究結(jié)果顯示，不育材料中SOD和CAT的活性低于可育材料[13-16]，而POD活性高于或低于可育材料，差異較大[17]。由以上研究可以推論，CMS與植物體內(nèi)較高的活性氧水平，以及由此產(chǎn)生的較高程度的膜脂過氧化有密切關(guān)系。本研究以玉米雄性不育系S37-2為研究材料，通過對其表型性狀、理化指標(biāo)的分析，初步探究其雄性不育的生理生化機理，以期為該不育系的實踐應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為C型胞質(zhì)雄性不育系S37-2及其保持系B37-2，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院羅紅兵教授提供。

1.2 試驗設(shè)計

試驗材料分別于2021年3月和8月種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園試驗基地。試驗土壤為紅色土，肥力水平中等。試驗采用小區(qū)種植，不育系S37-2與保持系B37-2均設(shè)置3次重復(fù)，每個試驗小區(qū)種植2行，行長3 m，每行10穴，穴距30 cm，行距50 cm。

玉米追肥于第7葉完全展開時進行，施用尿素300 kg·hm-2。分別在苗期(一葉一心期，幼苗)、拔節(jié)期(由上至下第5片葉)、抽雄期(雄穗尖端露出頂葉3～5 cm時，最上部展開葉)、散粉期(最上部展開葉)、成熟期(最上部展開葉)取相應(yīng)部位的葉片。將葉片冷凍于液氮中帶回，保存于-80 ℃冰箱。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 主要農(nóng)藝性狀調(diào)查

于成熟期，每小區(qū)隨機選取10株植株定株，調(diào)查其株高、穗位高、莖粗、莖節(jié)數(shù)、葉片數(shù)、穗位葉葉長、穗位葉葉寬、雄穗分枝數(shù)、雄穗長等性狀。

1.3.2 花器官形態(tài)特征調(diào)查

于散粉期，對各個材料花粉的育性進行調(diào)查。隨機剝?nèi)∩⒎鄣男鬯胫胁炕ㄋ?，選取測量10個花藥的長度和橫截面直徑，對比S37-2和B37-2的區(qū)別。

1.3.3 不同發(fā)育期葉片生理指標(biāo)測定

分別選取不同發(fā)育時期的葉片，測定其可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸、可溶性淀粉、丙二醛含量，以及CAT、SOD、POD活性。具體地，采用硫酸蒽酮法測定可溶性糖含量[18]，采用考馬斯亮藍(lán)比色法測定可溶性蛋白含量[19]，采用茚三酮比色法測定游離脯氨酸含量[20]，采用碘顯色法測定可溶性淀粉含量[21]，采用紫外吸收法測定CAT活性[13]，采用NBT光還原法測定SOD活性[22]，采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性[23]，采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定MDA含量[24]。每個樣品重復(fù)測定3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2020軟件整理數(shù)據(jù)，采用SAS 9.4軟件進行方差分析，對有顯著(P<0.05)差異的，采用Duncan法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要農(nóng)藝性狀比較

對比不育系S37-2與保持系B37-2的主要農(nóng)藝性狀差異(表1)。方差分析結(jié)果表明，S37-2的穗位葉葉長、葉寬均顯著高于B37-2，除此以外的其他性狀差異均不顯著。

表1 S37-2與B37-2的農(nóng)藝性狀比較

2.2 花藥表型特征比較

對比S37-2與B37-2的花藥發(fā)現(xiàn)，S37-2的花藥干癟皺縮，B37-2的花藥形狀飽滿(圖1)。對花藥表型性狀進行方差分析，結(jié)果表明，B37-2花藥的長度和橫截面直徑均顯著高于S37-2(表2)，S37-2花藥的長度僅為B37-2的68.52%，橫截面直徑僅為B37-2的40.00%。

圖1 不育系S37-2(左)與保持系B37-2(右)的花藥形態(tài)Fig.1 Anthers morphology of sterile line S37-2 (left) and maintainer line B37-2 (right)

表2 B37-2與S37-2的花藥性狀比較

2.3 不同發(fā)育期葉片營養(yǎng)物質(zhì)含量比較

隨著玉米植株的發(fā)育，可溶性蛋白含量在S37-2和B37-2葉片中均呈先降后升再降的趨勢(圖2)。S37-2的可溶性蛋白含量在散粉期達(dá)到最大值，B37-2的可溶性蛋白含量在出苗期達(dá)到最大值，兩者的可溶性蛋白含量均在成熟期最低。S37-2葉片中的可溶性蛋白含量在出苗期和拔節(jié)期顯著低于B37-2，在抽雄期和散粉期顯著高于B37-2，成熟期兩者差異不顯著。

同一時期柱上無相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。Bars marked without the same letters at the same growth stage indicate significant difference at P<0.05. The same as below.圖2 S37-2和B37-2葉片中的營養(yǎng)物質(zhì)含量比較Fig.2 Comparison of nutrients content in leaves of S37-2 and B37-2

從出苗期到成熟期，S37-2和B37-2葉片的游離脯氨酸含量變化趨勢基本一致，但S37-2在散粉期達(dá)到最大值，為158.57 μg·g-1。除拔節(jié)期和成熟期外，其他發(fā)育時期S37-2葉片中的游離脯氨酸含量均顯著高于B37-2，分別是B37-2的1.24、1.13和1.57倍。

從出苗期到成熟期，S37-2和B37-2的葉片可溶性糖含量變化趨勢一致，變化幅度較小，均隨植株發(fā)育先降后升再降，均在散粉期達(dá)到最大值，分別為3.56%、3.15%。拔節(jié)期—成熟期，S37-2的可溶性糖含量均顯著高于B37-2，分別為B37-2的1.13、1.03、1.17和1.05倍。

S37-2的葉片可溶性淀粉含量在各發(fā)育期變化幅度較小。B37-2的葉片可溶性淀粉含量隨植株發(fā)育呈先升后降的變化趨勢，在散粉期達(dá)最大值，并于成熟期下降。從出苗期到成熟期，S37-2的葉片可溶性淀粉含量均顯著低于同時期的B37-2，分別是B37-2的63.84%、48.88%、46.12%、48.80%和52.16%。

2.4 不同發(fā)育期葉片酶活性比較

隨著玉米植株的發(fā)育，S37-2與B37-2葉片的CAT活性均呈先降后升再降的趨勢(圖3)。S37-2葉片的CAT活性在散粉期最高，在拔節(jié)期最低；B37-2葉片的CAT活性也在散粉期最高，但在抽雄期最低。S37-2葉片的CAT活性在各時期均顯著低于B37-2，分別是B37-2的80.72%、80.47%、92.28%、81.55%和87.56%。

CAT、SOD、POD活性均以鮮重計。Activities of CAT， SOD and POD were measured based on fresh weight.圖3 S37-2和B37-2葉片中酶活性與丙二醛(MDA)含量的比較Fig.3 Comparison of enzymes activities and malondialdehyde (MDA) content in leaves of S37-2 and B37-2

從出苗期到成熟期，B37-2葉片的SOD活性均呈上升的趨勢，與B37-2相比，S37-2葉片的SOD活性在各時期都顯著更低。

在玉米葉片的發(fā)育過程中，S37-2和B37-2葉片中的POD活性總體呈先升后降的趨勢，最高值均出現(xiàn)在散粉期，分別為553.65、497.82 U·g-1(以鮮重計)，最低值均出現(xiàn)在出苗期。S37-2葉片中的POD活性在各個時期均顯著高于B37-2。

S37-2和B37-2葉片的MDA含量隨玉米發(fā)育均呈現(xiàn)先降后升的趨勢，在成熟期達(dá)到最大值。整個發(fā)育過程中，S37-2葉片的MDA含量與同時期的B37-2均無顯著差異。

3 討論

通過對S37-2和B37-2農(nóng)藝性狀的比較可知，S37-2的穗位葉葉長、葉寬顯著大于B37-2，這可能是由于S37-2的生殖生長受阻，更多的營養(yǎng)物質(zhì)用于葉片生長。S37-2的花藥形狀瘦小萎縮，飽滿度差，花藥的長度、橫截面直徑均顯著低于B37-2，這與趙宇等[13]的研究結(jié)果一致。

植物在發(fā)育過程中需要大量的蛋白、淀粉、糖與氨基酸，當(dāng)這些物質(zhì)的合成和運輸路徑受阻時，植物雄穗花藥的生長發(fā)育將會受到影響，甚至產(chǎn)生不育的現(xiàn)象[25]。營養(yǎng)物質(zhì)的缺失會導(dǎo)致小麥[26]、大豆[27]等作物的小孢子敗育。李玉青等[28]的研究表明，不育系中的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量較低。本研究發(fā)現(xiàn)，在S37-2與B37-2之間，其葉片的營養(yǎng)物質(zhì)含量差異變化并沒有特別明顯的規(guī)律性，與其他雄性不育材料整個發(fā)育期營養(yǎng)物質(zhì)均明顯缺乏的現(xiàn)象不一致。推測這可能與該類型材料雄性不育的發(fā)生時期相關(guān)，也可能與試驗材料的取樣部位、試驗環(huán)境等有關(guān)。S37-2葉片中的可溶性蛋白、游離脯氨酸和可溶性糖含量均在抽雄期與散粉期顯著高于B37-2。據(jù)此推測，S37-2葉片中這3種物質(zhì)的運輸路徑受阻，無法向雄穗提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，從而影響小孢子的發(fā)育和育性表現(xiàn)，導(dǎo)致敗育。這也進一步說明，玉米的雄性不育會受到物質(zhì)代謝的影響。

玉米正常的生長發(fā)育需要植物抗氧化酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，防止膜脂過氧化，維持動態(tài)平衡。前人研究發(fā)現(xiàn)，CMS花藥敗育過程中，CAT、SOD、POD等酶的活性存在不同程度的波動。柴偉國等[29]發(fā)現(xiàn)，辣椒不育系的花藥POD活性明顯高于保持系；蔣會兵等[30]發(fā)現(xiàn)，厚軸茶不育株花蕾中的CAT、SOD活性顯著低于可育株，POD活性高于可育株；鄧杰[5]、鄒佳等[14]研究玉米雄性不育系發(fā)現(xiàn)，不育系中CAT、SOD活性低。本試驗結(jié)果表明，在生長發(fā)育的各個時期，S37-2葉片中的CAT和SOD活性均顯著低于保持系(B37-2)，這與其他學(xué)者在小麥和水稻等雄性不育系上的研究[31-32]相似。同時，本研究發(fā)現(xiàn)S37-2的POD活性顯著高于B37-2。這可能是不育株的自我保護反應(yīng)，但也可能會造成花粉內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的匱乏，最終導(dǎo)致雄性不育的發(fā)生[33-34]。

綜上推測，S37-2葉片中的可溶性蛋白、游離脯氨酸和可溶性糖的運輸路徑受阻，以及CAT和SOD活性降低，可能是導(dǎo)致其雄性不育的重要原因。上述結(jié)果僅反映了玉米雄性不育系S37-2葉片發(fā)育過程中的生理生化變化趨勢，其他方面還需進一步深入研究。