蘇 曼王 昊黃玉浩周文明顧 薇*陳 軍

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023； 2.江蘇省中醫(yī)外用藥開發(fā)與應(yīng)用工程研究中心，江蘇南京 210023； 3.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023； 4.連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 連云港 222000； 5.安徽老孫頭鞋業(yè)有限公司，安徽 宿州 235200； 6.上海楊思醫(yī)院，上海 200126； 7.江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

手癬、足癬中醫(yī)又稱鵝掌風(fēng)、腳濕氣，是一種常見的皮膚科真菌感染性疾病，其發(fā)病率高、難以痊愈、易反復(fù)發(fā)作、傳染性強(qiáng)，極大影響人類健康和生活質(zhì)量。足癬分為水皰型、浸漬糜爛型、角化過度型、丘疹鱗屑型，引發(fā)的致病真菌包括紅色毛癬菌、絮狀表皮癬菌、趾間毛癬菌、石膏樣小孢子菌、犬小孢子菌等，其中紅色毛癬菌是主要致病真菌，在臨床檢測(cè)中占80%左右，其次是須癬毛癬菌、絮狀表皮癬菌等［1-5］。

目前手足癬的治療多以西藥為主，以唑類和丙烯胺類藥物為代表，而西藥的耐藥問題是很多患者久治不愈的關(guān)鍵原因。中藥具有來源廣泛、毒副作用小、廣譜、藥效長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，可在真菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生多方面的藥理效應(yīng)，而很少出現(xiàn)耐藥，適用于病程較長(zhǎng)的皮膚癬菌病［6］。檢索2020 年版《中國(guó)藥典》 《方劑大辭典》 《欽定四庫(kù)全書子部·腳氣治法綱要卷》及臨床試驗(yàn)論文，篩選分析其中治療手足癬的中藥復(fù)方，結(jié)合臨床醫(yī)師建議，系統(tǒng)篩選得到26 味手足癬復(fù)方中的常用藥材（表1），其以辛溫、苦寒藥材為主。本研究以紅色毛癬菌為評(píng)價(jià)菌種，考察26 味中藥的抑菌效果，對(duì)藥效顯著的藥材進(jìn)行成分分析與效應(yīng)物質(zhì)研究，為中藥抗真菌藥物的臨床選用、配伍與機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

BSC-1604IIA2 型生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ULTROSPEC 10 CLASSIC 濁度儀，美國(guó)Harvard Apparatus 公司；B6120 型培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Fisher 公司；Epoch2 TC 型酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek 公司；PB21 型PH 儀，德國(guó)賽多利斯公司；AG135 十萬(wàn)分之一天平、XS205 型電子天平，瑞士Mettler-Toledo 公司；Ti-S 型顯微鏡，日本尼康公司；704767-C100002 型培養(yǎng)皿，青島阿爾發(fā)醫(yī)療器械有限公司；Agilent 1260 Infinity HPLC、Agilent 6530B Accurate-Mass Q-TOF，美國(guó)Agilent 公司；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。Trichophyton rubrumATCC MYA-4438 購(gòu)自美國(guó)ATCC 中心。

中藥飲片（表1）均購(gòu)自亳州紫銳藥業(yè)有限公司、蘇州市天靈中藥飲片有限公司，由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉圣金副教授鑒定為正品。氟康唑（批號(hào)F8929-100MG）、MOPs（批號(hào)M1254-1KG）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；RPMI 1640 粉末（批號(hào)Gibco-31800-022）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)HB0233-12）購(gòu)自青島海博生物有限公司。土荊皮丙酸（成都格利普生物科技有限公司，批號(hào)18033002）；土荊皮乙酸（大連美侖生物科技有限公司，批號(hào)J0826AS）；氧化苦參堿、歐前胡素、苦參堿、蛇床子 素、丁香酚（批號(hào) Y30S6Y17043、D07S10E97290、T03F9F54046、T08M8B30733、H22A10Z86166，上海源葉生物科技有限公司）；乙?；∠惴?、百部堿（南京金益柏生物科技有限公司，批號(hào)191103、190321）；苦參酮（成都格利普生物科技有限公司，批號(hào)190120）。

表1 處方分析篩選出的27 味藥材

2 方法

2.1 藥材提取 將藥材粉碎后過2 號(hào)篩，精密稱定10 g 于具塞錐形瓶中，加10 倍量75%乙醇，50 ℃水浴鍋中浸泡12 h 后，50 ℃超聲處理1 h，過濾后取濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干溶劑，50 ℃烘箱烘干48 h，得中藥提取物，－20 ℃條件下保存。

2.2 體外抗紅色毛癬菌的藥效研究 實(shí)驗(yàn)過程遵照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，以最低抑制濃度（MIC）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察藥物／化合物抗紅色毛癬菌藥效。

將冷凍保存的紅色毛癬菌甘油管劃線接種PDA 平板，置于35 ℃、相對(duì)濕度80%條件下培養(yǎng)6 d。用5 mL 0.9%NaCl 溶液覆蓋平板，用涂布器輕輕刮平板表面，獲得孢子懸液。稀釋100 倍，使用顯微鏡及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果為47、57、44、54，則原液孢子為505 000／mL。將800 μL 菌液加至250 mL 測(cè)試培養(yǎng)基，獲得接種液。

將待測(cè)化合物及氟康唑溶解于DMSO，配制成待測(cè)化合物51.2 mg／mL、氟康唑12.8 mg／mL。將氟康唑用DMSO稀釋2 倍（即6.4 mg／mL），備用。待測(cè)化合物在96 孔板中進(jìn)行梯度稀釋，得到質(zhì)量濃度51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0 mg／mL 的溶液。氟康唑在96 孔板中進(jìn)行梯度稀釋，得到質(zhì)量濃度6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25、0 mg／mL 的溶液。從化合物母板中轉(zhuǎn)移2 mL 化合物工作液，加于含培養(yǎng)基的96-U 孔板，獲得化合物檢測(cè)板。所有組別平行3 份。在化合物檢測(cè)板中加入198 μL 各真菌接種液，獲得MIC 檢測(cè)板。將MIC 檢測(cè)板置于35 ℃、相對(duì)濕度80% 條件下，靜置培養(yǎng)4 d 后讀取MIC 數(shù)值［6］。用油鏡觀察藥材在MIC 濃度培養(yǎng)后的菌絲狀態(tài)。

2.3 色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），丁香、蛇床子、百部、大黃、土荊皮按表2 進(jìn)行梯度洗脫，苦參按表3 進(jìn)行梯度洗脫；柱溫30 ℃；體積流量0.3 mL／min；進(jìn)樣量1 μL。

表2 梯度洗脫程序

表3 梯度洗脫程序

2.4 質(zhì)譜條件 毛細(xì)管電壓5 500 V（正離子模式）、－4 500 V（負(fù)離子模式）；洗脫溶劑溫度550 ℃；氣簾氣壓力241.3 kPa；霧化器壓力379.2 kPa。取“2.1” 項(xiàng)下制備供試品，用75%乙醇稀釋100 倍，離心后取上清液進(jìn)樣測(cè)定。

2.5 藥材成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的建立與分析 利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)建立中藥的成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。利用MassHunter 對(duì)藥材的質(zhì)譜圖進(jìn)行成分分析，與自建數(shù)據(jù)庫(kù)中成分匹配，篩選出相對(duì)含量大于1%的成分，成分的二級(jí)質(zhì)譜碎片與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜數(shù)據(jù)、Massbank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

3 結(jié)果

3.1 體外抗紅色毛癬菌藥效 苦參、土荊皮的抑菌效果最好，MIC 值為64 μg／mL；大黃、丁香、蛇床子、百部具有較好的抑菌效應(yīng)，MIC 值為64 μg／mL，見表4。

表4 對(duì)紅色毛癬菌最小抑菌濃度（MIC）

選取抗紅色毛癬菌效果優(yōu)良的6 味中藥（苦參、土荊皮、大黃、丁香、蛇床子、百部），用油鏡觀察其在MIC 濃度培養(yǎng)后的菌絲狀態(tài)（圖1）。6 味中藥提取物不同程度地展現(xiàn)出對(duì)紅色毛癬菌細(xì)胞壁與細(xì)胞膜的破壞作用，菌絲細(xì)胞壁均有融合的趨勢(shì)［6］。

圖1 紅色毛癬菌油鏡圖

3.2 成分分析 各中藥提取物與相應(yīng)混合對(duì)照品的提取離子色譜圖見圖2。以MassHunter 對(duì)離子色譜圖進(jìn)行分析，根據(jù)加合離子［M＋H］＋信息判斷并得到一級(jí)質(zhì)譜精確相對(duì)分子質(zhì)量，通過MassHunter 軟件數(shù)據(jù)庫(kù)擬合化合物分子式，將結(jié)果與文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)各色譜峰進(jìn)行初步推測(cè)。篩選信噪比較好的二級(jí)質(zhì)譜圖以獲取色譜峰的二級(jí)質(zhì)譜信息，并獲得化合物相應(yīng)的碎片離子，根據(jù)離子的裂解情況及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)并推測(cè)化學(xué)成分。將相對(duì)含量較高成分與標(biāo)準(zhǔn)品的二級(jí)譜圖進(jìn)行比對(duì)，對(duì)成分進(jìn)行確認(rèn)，見表5。

表5 藥材成分分析

圖2 離子色譜圖

3.3 抗紅色毛癬菌作用機(jī)制 土荊皮乙酸、歐前胡素、蛇床子素、苦參酮均顯示較強(qiáng)抗紅色毛癬菌的抑菌作用，MIC值為16 μg／mL，其土荊皮丙酸、苦參堿、氧化苦參堿、百部堿等成分無抗紅色毛癬菌作用，結(jié)果見表6。

表6 對(duì)紅色毛癬菌最小抑菌濃度（MIC）

4 討論

篩選出的6 味藥材對(duì)紅色毛癬菌菌絲的細(xì)胞壁均有不同程度的融合趨勢(shì)。破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性正是大部分天然提取物對(duì)真菌作用的主要機(jī)理［7-11］，抑菌效果最好的是苦參和土荊皮。中醫(yī)的辨證論治認(rèn)為本病多因濕熱下注或血虛風(fēng)燥引起，亦可因接觸患者的用具沾染蟲毒導(dǎo)致［12］。香豆素類成分歐前胡素、蛇床子素和土荊皮乙酸對(duì)紅色毛癬菌有較好的抑菌效果，丁香酚、乙?；∠惴?、苦參酮有一定的抑菌效果［13-15］。苦參堿、氧化苦參堿、百部堿無抗紅色毛癬菌效應(yīng)，這可能與菌種差異有關(guān)［16-17］。一種藥物對(duì)不同菌株的作用不同，可能與其作用靶點(diǎn)不同有關(guān)［18］。

以紅色毛癬菌為代表的足癬真菌多適宜在堿性環(huán)境下生長(zhǎng)，故將患處浸泡于酸性環(huán)境是臨床上治療足癬的常用方法［19-20］。對(duì)紅色毛癬菌有較好抑制作用的6 種成分均顯示不同程度的酸性，如乙?；∠惴印⑼燎G皮乙酸因具羧基而顯酸性，丁香酚、苦參酮因具酚羥基而顯示出一定的酸性，香豆素類化合物則多呈中性或弱酸性；相反，生物堿類成分卻顯示較弱抗紅色毛癬菌效應(yīng)，提示中藥成分對(duì)真菌生長(zhǎng)環(huán)境酸堿性的改變可能是發(fā)揮其抗菌抑菌作用的重要原因［21］。同時(shí)，正常人表面皮膚呈弱酸性，保持正常的酸性狀態(tài)也是保護(hù)皮膚抗細(xì)菌和真菌侵害的重要條件［22］。

本研究從篩選抗菌藥物到藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，一定程度闡釋中藥抗菌的機(jī)制，為針對(duì)紅色毛癬菌引起的皮膚疾病的藥物研制提供科學(xué)依據(jù)。