宋俊華，張 瀝，陳海濱

（長(zhǎng)沙市第四醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖南 長(zhǎng)沙 410006）

糖尿病性心肌病是由糖尿病引起的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損的一種疾病［1］，該病在糖尿病患者中很常見，其發(fā)生率高達(dá)75%［2］。高血糖引起的氧化應(yīng)激、組織炎癥、細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是糖尿病性心肌病發(fā)病機(jī)理和進(jìn)展的關(guān)鍵［3］。因此，開發(fā)抑制糖尿病性心肌病患者氧化應(yīng)激、組織炎癥水平并降低細(xì)胞凋亡，進(jìn)而降低心肌細(xì)胞損傷的治療方法具有重要意義。山藥多糖是山藥中有效成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫、降低血糖等作用［4］。相關(guān)研究報(bào)道，山藥多糖在改善脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中具有重要作用［5］，而Wnt／β-連環(huán)蛋白（Wnt／βcatenin）信號(hào)通路作為參與細(xì)胞多種生命活動(dòng)的重要通路之一，抑制該通路可使高糖誘導(dǎo)的H9c2 心肌細(xì)胞凋亡率下降［6］，但尚未見山藥多糖通過(guò)調(diào)控Wnt／β-catenin 信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的報(bào)道。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型，觀察山藥多糖對(duì)心肌細(xì)胞損傷模型細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎性因子水平及Wnt／β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響，旨在探索可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 大鼠心肌細(xì)胞H9c2（貨號(hào)C5045）購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司。

1.2 試劑與藥物 山藥多糖（純度≥90%，貨號(hào)SC9990）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；蛋白提取試劑盒、BCA 試劑盒均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；ELISA 試劑盒購(gòu)自上海恪敏生物科技有限公司；硫代巴比妥酸反應(yīng)物檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；ROS 檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；黃嘌呤氧化酶活性測(cè)定試劑盒、Wnt3α、β-catenin、糖原合成激酶3β（GSK-3β）、GAPDH兔多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。

1.3 細(xì)胞分組及給藥 參照文獻(xiàn)［5，7］報(bào)道及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將H9c2 細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、高糖組、山藥多糖組、山藥多糖＋LiCl（Wnt／β-catenin 信號(hào)通路激活劑）組。對(duì)照組以含有5.55 mmol／L 葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，高糖組以含有33 mmol／L 葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，山藥多糖組以含有33 mmol／L 葡萄糖和0.20 mg／mL 山藥多糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，山藥多糖＋LiCl 組以含有33 mmol／L 葡萄糖、0.20 mg／mL 山藥多糖和40 μmol／L LiCl 的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。

1.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 細(xì)胞按“1.3” 項(xiàng)下方法處理，收集各組細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)的密度接種在96 孔板中，同時(shí)設(shè)置只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的空白組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)72 h 后向每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃避光孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞按“1.3” 項(xiàng)下方法處理，收集各組細(xì)胞（5×105／mL），加入100 μL 結(jié)合緩沖液，輕輕重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC 和5μL碘化丙啶，將細(xì)胞輕輕混合，并在室溫下避光孵育10 min，使用流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。

1.6 細(xì)胞ROS、MDA 水平和SOD 活性檢測(cè) 細(xì)胞按“1.3” 項(xiàng)下方法處理，收集各組細(xì)胞，分別使用活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（熒光探針?lè)ǎ?、丙二醛檢測(cè)試劑盒（硫代巴比妥酸法）、超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒（黃嘌呤氧化法）檢測(cè)細(xì)胞ROS、MDA 水平和SOD 活性，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，以相對(duì)熒光強(qiáng)度（MFI）值代表ROS 水平，每個(gè)樣本重復(fù)6 次實(shí)驗(yàn)。

1.7 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6 水平 細(xì)胞按“1.3” 項(xiàng)下方法處理，收集各組細(xì)胞上清液，采用ELISA 試劑盒檢測(cè)上清液中IL-1β、IL-6 水平，每個(gè)樣本重復(fù)6 次實(shí)驗(yàn)。

1.8 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞Wnt3α、β-catenin、GSK-3β蛋白表達(dá) 細(xì)胞按“1.3” 項(xiàng)下方法處理，收集各組細(xì)胞，加入預(yù)冷的RIPA 緩沖液在4 ℃下裂解45 min，使用BCA試劑盒對(duì)總蛋白進(jìn)行定量。通過(guò)12% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后移至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，與一抗β-catenin（1∶2 000）、Wnt3α（1∶1 000）、GSK-3β（1∶3 000）、GAPDH（1∶2 500）在4 ℃下孵育過(guò)夜，PBST 洗滌3 次，與HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶5 000）在室溫下孵育2 h，使用ECL 化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)可視化蛋白質(zhì)條帶，Image J 軟件量化蛋白質(zhì)條帶，并以GAPDH為內(nèi)參，分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)，每個(gè)樣本重復(fù)6 次實(shí)驗(yàn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 25.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山藥多糖對(duì)細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞活力降低（P＜0.05）；與高糖組比較，山藥多糖組細(xì)胞活力升高（P＜0.05）；與山藥多糖組比較，山藥多糖＋LiCl 組細(xì)胞活力降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組細(xì)胞活力比較（±s， n＝6）

表1 各組細(xì)胞活力比較（±s， n＝6）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，＃P＜0.05；與山藥多糖組比較，△P＜0.05。

2.2 山藥多糖對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響 與對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與高糖組比較，山藥多糖組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與山藥多糖組比較，山藥多糖＋LiCl 組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），見圖1、表2。

圖1 各組細(xì)胞凋亡情況流式圖

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較（±s， n＝6）

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較（±s， n＝6）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，＃P＜0.05；與山藥多糖組比較，△P＜0.05。

2.3 山藥多糖對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響 與對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞ROS、MDA 水平升高（P＜0.05），SOD 活性降低（P＜0.05）；與高糖組比較，山藥多糖組細(xì)胞ROS、MDA 水平降低（P＜0.05），SOD 活性升高（P＜0.05）；與山藥多糖組比較，山藥多糖＋LiCl 組細(xì)胞ROS、MDA 水平升高（P＜0.05），SOD 活性降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組細(xì)胞ROS、MDA 水平和SOD 活性比較（±s， n＝6）

表3 各組細(xì)胞ROS、MDA 水平和SOD 活性比較（±s， n＝6）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，＃P＜0.05；與山藥多糖組比較，△P＜0.05。

2.4 山藥多糖對(duì)細(xì)胞上清液中炎癥因子水平的影響 與對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6 水平升高（P＜0.05）；與高糖組比較，山藥多糖組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.05）；與山藥多糖組比較，山藥多糖＋LiCl 組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6 水平升高（P＜0.05），見表4。

表4 各組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6 水平比較（μg／L，±s， n＝6）

表4 各組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6 水平比較（μg／L，±s， n＝6）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，＃P＜0.05；與山藥多糖組比較，△P＜0.05。

2.5 山藥多糖對(duì)細(xì)胞中Wnt／β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞Wnt3α、β-catenin 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），GSK-3β 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與高糖組比較，山藥多糖組細(xì)胞Wnt3α、β-catenin 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），GSK-3β 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與山藥多糖組比較，山藥多糖＋LiCl 組細(xì)胞Wnt3α、β-catenin蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），GSK-3β 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見圖2、表5。

圖2 各組細(xì)胞Wnt3α、β-catenin、GSK-3β 蛋白條帶圖

表5 各組細(xì)胞Wnt3α、β-catenin、GSK-3β 蛋白表達(dá)比較（±s， n＝6）

表5 各組細(xì)胞Wnt3α、β-catenin、GSK-3β 蛋白表達(dá)比較（±s， n＝6）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，＃P＜0.05；與山藥多糖組比較，△P＜0.05。

3 討論

糖尿病性心肌病是一種涉及線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、自噬、細(xì)胞凋亡和心肌代謝異常的一種疾?。?］。目前普遍認(rèn)為高糖條件下的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡是造成心肌細(xì)胞損傷主要原因，同時(shí)也是糖尿病性心肌病發(fā)病機(jī)制之一［9-10］。據(jù)報(bào)道，心肌細(xì)胞在受損時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，不僅可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還能將細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化，造成氧化損傷［11-13］。本研究通過(guò)葡萄糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)高糖可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷。

山藥多糖具有調(diào)節(jié)免疫力、抗衰老、降血糖、降血脂、抗氧化、抗應(yīng)激等多種功能活性［14］。有研究表明，山藥多糖可抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，改善腦組織抗氧化能力及抑制炎性細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而減少缺血再灌注損傷大鼠腦梗死面積［15］；山藥多糖還可以對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用［5］。本研究結(jié)果亦表明山藥多糖對(duì)心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

Wnt／β-catenin 信號(hào)通路能夠參與介導(dǎo)機(jī)體各種生理病理反應(yīng)［16］。在Wnt／β-catenin 信號(hào)通路中，Wnt3α 是激活Wnt／β-catenin 通路的Wnt 同源物，其能促進(jìn)一系列蛋白活化最終導(dǎo)致β-catenin 蛋白的大量積累；而GSK-3β 作為Wnt／β-catenin 信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，其能夠促進(jìn)βcatenin 的降解，當(dāng)GSK-3β 不足或者發(fā)生障礙時(shí)，β-catenin會(huì)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量累積［17-18］，因此Wnt3α、β-catenin、GSK-3β 可作為評(píng)估Wnt／β-catenin 信號(hào)通路活性的重要依據(jù)。相關(guān)研究表明，Wnt／β-catenin 抑制劑XAV939 通過(guò)抑制Wnt／β-catenin 信號(hào)通路降低大鼠心肌組織中促纖維化因子的表達(dá)及膠原的濃度并抑制心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而阻止心肌梗死后心肌纖維化的發(fā)生與發(fā)展［19］；miR-124-3p 抑制劑可通過(guò)抑制Wnt／β-catenin 信號(hào)通路，進(jìn)一步抑制心肌細(xì)胞的凋亡，減輕細(xì)胞損傷，減少炎性因子的釋放，對(duì)缺氧缺糖的心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用［20］；右美托咪定通過(guò)抑制Wnt／β-catenin 信號(hào)通路激活，降低促凋亡因子Bax 表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡因子Bcl-2 表達(dá)，進(jìn)而緩解新生大鼠缺氧缺血性腦損傷［21］。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)可通過(guò)上調(diào)Wnt3α、βcatenin 蛋白表達(dá)，下調(diào)GSK-3β 蛋白表達(dá)來(lái)激活Wnt／βcatenin 信號(hào)通路，而山藥多糖處理后可抑制該通路的激活。此外，本研究還利用Wnt／β-catenin 信號(hào)通路激活劑LiCl 處理心肌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可逆轉(zhuǎn)山藥多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力、凋亡、炎性因子和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響，提示山藥多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制與Wnt／β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，山藥多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其可增強(qiáng)細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎性因子水平，該機(jī)制與抑制Wnt／β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)，可為臨床上糖尿病性心肌病的治療提供參考依據(jù)。