王浩南，吳雨蒙，張 喆，梁夢(mèng)夢(mèng)，劉 謙，，張永清*

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355； 2.山東沃華醫(yī)藥科技股份有限公司博士后流動(dòng)站，山東濰坊 261000）

丹參屬于大宗常用中藥材，為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根與根莖［1］，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，丹參含有丹參酮類、丹酚酸類等活性成分，具有抑菌［2］、抗炎［3］、抑制新生血管［4-5］、抗血栓、抗心肌缺血再灌注損傷、抗癌等藥理作用［6-9］。皮膚創(chuàng)傷在臨床上極為常見(jiàn)，后期愈合過(guò)程中極易形成瘢痕，影響美觀，導(dǎo)致患者產(chǎn)生“揮之不去的陰影，難以言表的憂傷”，關(guān)節(jié)處瘢痕組織甚至?xí)适Р糠止δ?，?yán)重影響生活質(zhì)量。皮膚創(chuàng)傷愈合分為止血、炎癥、愈合、重塑4 個(gè)時(shí)期［10-11］。研究顯示，丹參及其制劑具有加快創(chuàng)面愈合、降低感染率、減輕水腫、減少瘢痕形成等作用［12-13］。課題組發(fā)掘了一個(gè)以丹參為主要原料用于消除皮膚創(chuàng)傷瘢痕的民間驗(yàn)方，并在工藝研究的基礎(chǔ)上研制成滅瘢膏。本研究對(duì)滅瘢膏的活性成分進(jìn)行了檢測(cè)，并通過(guò)動(dòng)物與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)其減少瘢痕殘留的作用及機(jī)制進(jìn)行研究，旨在為新產(chǎn)品研制和丹參資源充分利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695 高效液相色譜（美國(guó)Waters 公司）；Spectra Max M2 酶標(biāo)儀［美谷分子儀器（上海）有限公司］；Scientz-24 高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；IX71 生物倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試劑與藥物 丹參飲片原植物由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園種植，2019 年11 月采收后去除泥土，切片，曬干，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張永清教授鑒定為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.。蒸餾水、超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）；0.9%生理鹽水（辰欣藥業(yè)股份有限公司）；甲醇、乙醇（天津富宇精細(xì)化工有限公司）。羊脂（泰安明睿建設(shè)工程有限公司）；白凡士林（南昌白云藥業(yè)有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；丹參素、二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮ⅡA對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、I 型膠原蛋白（Col1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）抗體（英國(guó) Abcam 公司）；TGF-β3抗體（美國(guó)ImmunoWay 公司）；總蛋白（BCA 法）測(cè)定試劑盒、VEGF-A、EGF ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；人源VEGF、EGF ELISA 試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）。

2 方法

2.1 藥物制備

2.1.1 羊脂 取純凈羊脂置于鍋中，2 000 W 加熱23 min，放涼后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 滅瘢膏 取羊脂400 g 置于鍋中，2 000 W 加熱20 min，丹參飲片160 g 用蒸餾水濕潤(rùn)攪拌均勻后加入進(jìn)行煎炸（1 600 W，3 min），炸至丹參飲片外圈發(fā)黑、體積縮小，中心發(fā)黃后停止加熱，過(guò)濾，去渣，羊脂部分放冷4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 丹參酮軟膏 按照110 mg 隱丹參酮、105 mg 丹參酮ⅡA與50 g 白凡士林60 ℃混勻，冷卻，4 ℃冷藏備用。

2.2 滅瘢膏活性成分提取與含量測(cè)定 取1 g 滅瘢膏分別用20 倍量蒸餾水、80% 乙醇，40 ℃超聲提取2 h，放冷，溶劑與油層分離后收集溶劑層，通風(fēng)櫥放置揮干，加20 mL甲醇溶解，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，－20 ℃冷藏備用供HPLC 分析。

色譜條件為ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 nm×250 nm，5 μm）；流動(dòng)相0.01% 磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；丹酚酸類檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm，丹參酮類檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠，4 周齡，體質(zhì)量（180±20）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0008，SPF 環(huán)境單只單籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 分組、造模及給藥 60 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、丹參酮軟膏組、滅瘢膏組、羊脂組，每組15 只，用乙醚麻醉，剃凈背部毛發(fā)，手術(shù)剪裁去背部脊椎兩側(cè)對(duì)稱的2 個(gè)1.0 cm×1.0 cm 面積皮膚，深入皮下，消毒，即造模完成，造模與取材位置見(jiàn)圖1 缺口部分。對(duì)照組只用繃帶包扎；羊脂組、滅瘢膏組、丹參酮軟膏組涂抹相應(yīng)藥物后繃帶包扎，造模第1 天開(kāi)始給藥，每天1 次，每次1 g。

圖1 大鼠造模及取材位置示意圖

2.3.3 創(chuàng)傷愈合率測(cè)定 采用透明膜描記稱重法測(cè)定傷口面積，給藥第0、3、7、11、15 天，用透明膜描記創(chuàng)面大小，以此為模板，將質(zhì)地均勻的硬紙片剪成同樣大小，稱定硬紙片質(zhì)量，硬紙片質(zhì)量表示創(chuàng)面面積大小，計(jì)算創(chuàng)傷愈合率，公式為創(chuàng)傷愈合率＝（第0 天創(chuàng)傷面積－第N 天創(chuàng)傷面積）／第0 天創(chuàng)傷面積×100%。

2.3.4 樣品處理與總蛋白、生長(zhǎng)因子測(cè)定 給藥7 d 后選取7 只大鼠，處死取左右兩側(cè)愈傷組織（均為大鼠背部?jī)蓚?cè)造模位置的愈傷組織）標(biāo)記為A 組，經(jīng)液氮速凍后于－80 ℃保存；給藥15 后處死剩余8 只大鼠，取左右兩側(cè)愈傷組織標(biāo)記為B 組，經(jīng)液氮速凍后于－80 ℃保存。B 組左側(cè)愈傷組織進(jìn)行Masson、天狼猩紅染色，使用Image J 軟件（IHC Tool Box 插件）計(jì)算膠原纖維染色面積比例；取A、B 兩組右側(cè)愈傷組織（0.1±0.01）g，加生理鹽水制成10%組織勻漿液，4 ℃、6 000 r／min 離心10 min，取上清液用蛋白定量測(cè)定試劑盒、VEGF-A 及EGF ELISA 試劑盒測(cè)定總蛋白及EGF、VEGF-A 水平，其中各生長(zhǎng)因子水平＝各生長(zhǎng)因子含量／各樣品總蛋白水平。

2.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.4.1 細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng) 人皮膚成纖維細(xì)胞（HFF-1）、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（EA.hy926）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。EA.hy926、HaCaT 細(xì)胞使用含10% 胎牛血清、100 U／mL 雙抗的DMEM 培養(yǎng)基；HFF-1 細(xì)胞使用HFF-1 完全培養(yǎng)液，于5% CO2、37 ℃、相對(duì)飽和濕度95%條件下松蓋培養(yǎng)，每天換液1 次，細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)消化傳代，取第3～8 代后對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.4.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 EA.hy926、HaCaT、HFF-1 細(xì)胞調(diào)整密度至4×104／mL，接種于96 孔板，每孔100 μL，孵育過(guò)夜。細(xì)胞分為對(duì)照組（0 μmol／L）和給藥組（1、2、4、8、16、32 μmol／L，1 μmol／L 藥物為1 μmol隱丹參酮＋1 μmol 丹參酮ⅡA混合溶于1 L 的DMSO），另設(shè)空白組（無(wú)細(xì)胞），給藥培養(yǎng)48 h 后，每孔加入10 μL 5 mg／mL MTT，繼續(xù)孵育5 h，于酶標(biāo)儀595 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

2.4.3 劃痕實(shí)驗(yàn) HaCaT 細(xì)胞以無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，給藥濃度為0 μmol／L（0%抑制濃度，丹參酮ⅡA＋隱丹參酮混合物）、1 μmol／L（20% 抑制濃度）、3 μmol／L（50% 抑制濃度），12 h后用10 μL 槍頭在細(xì)胞板上劃痕，0、16、32、48 h于倒置顯微鏡下觀察各給藥濃度HaCaT 細(xì)胞遷移率。

2.4.4 細(xì)胞生長(zhǎng)因子檢測(cè) 取HFF-1、HaCaT、EA.hy926細(xì)胞混懸液，用0%、20%、50%抑制率濃度給藥處理48 h，收集細(xì)胞，按照EGF、VEGF-A ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)EGF、VEGF 水平。

2.4.5 Western blot 法檢測(cè)愈傷組織和細(xì)胞TGF-β1、TGFβ3、Col1 蛋白表達(dá) 分別取愈傷組織樣本和細(xì)胞樣本，加150 μL 裂解液超聲1 min 后于0 ℃裂解45、30 min，4 ℃、12 000 r／mim 離心15 min 后吸取上清液，用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度，在10% SDS-PAGE 凝膠電泳中分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，室溫封閉1 h，加一抗TGF-β1（1∶500）、TGF-β3（1∶500）、Col1（1∶500）、GAPDH（1∶5 000）4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜3 次后加過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG 二抗，室溫孵育40 min，洗膜3 次后加免疫增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑（ECL），顯影，曝光，保存條帶圖進(jìn)行分析，GAPDH 為內(nèi)參蛋白。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 23.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 滅瘢膏中活性成分 滅瘢膏水、醇提取物經(jīng)HPLC 分析，結(jié)果見(jiàn)圖2～3，滅瘢膏水提取物只含丹參素，含量為0.565 9 mg／g；乙醇提取物中主要含有隱丹參酮、丹參酮ⅡA、二氫丹參酮，含量分別為2.196、2.111、0.346 mg／g，隱丹參酮、丹參酮ⅡA是滅瘢膏中的主要成分。

圖2 滅瘢膏水提取物HPLC 色譜圖

3.2 滅瘢膏對(duì)大鼠愈傷組織切片Masson、天狼猩紅染色的影響 如圖4、表1 所示，與對(duì)照組、羊脂組比較，滅瘢膏組和丹參酮軟膏組大鼠愈傷組織肌紅纖維水平增加，膠原纖維水平降低（P＜0.01），說(shuō)明滅瘢膏組和丹參酮軟膏組均具有降低瘢痕形成的作用，滅瘢膏中有效成分為丹參酮類成分。如圖5、表1 所示，滅瘢膏和丹參酮軟膏能增加I 型膠原水平（P＜0.01），說(shuō)明隱丹參酮、丹參酮ⅡA具有分解膠原纖維或抑制I 型膠原合成膠原纖維的作用。

表1 各組Masson、天狼猩紅染色結(jié)果比較（%，±s，n＝8）

表1 各組Masson、天狼猩紅染色結(jié)果比較（%，±s，n＝8）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與羊脂組比較，＃＃ P＜0.01。

圖3 各成分HPLC 色譜圖

圖4 各組Masson 染色（×400）

圖5 各組天狼猩紅染色（×400）

3.3 滅瘢膏對(duì)大鼠傷口愈合率的影響 第3、7 天時(shí)，與對(duì)照組比較，滅瘢膏組和丹參酮軟膏組創(chuàng)面愈合率均增加（P＜0.01）；第15 天時(shí)，所有大鼠傷口均愈合，接近閉合，說(shuō)明丹參酮類成分在減少疤痕形成的基礎(chǔ)上不會(huì)延緩創(chuàng)面愈合速率，同時(shí)在第3、7 天，丹參酮具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較（%，±s， n＝8）

表2 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較（%，±s， n＝8）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與羊脂組比較，＃＃P＜0.01。

3.4 滅瘢膏對(duì)大鼠愈傷組織VEGF-A、EGF 水平的影響表3 顯示，第7 天，與對(duì)照組比較，滅瘢膏組和丹參酮軟膏組大鼠愈傷組織VEGF-A 水平降低（P＜0.05），EGF 水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；第15 天，與對(duì)照組比較，滅瘢膏組和丹參酮軟膏組大鼠愈傷組織VEGF-A、EGF 水平均升高（P＜0.05），前期抑制血管生成與促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖，說(shuō)明丹參酮能夠促進(jìn)愈傷組織正常的增殖發(fā)育，同時(shí)抑制毛細(xì)血管的過(guò)度增殖，減少瘢痕相關(guān)蛋白的沉積。

表3 各組大鼠愈傷組織VEGF-A、EGF 水平比較（±s， n＝7）

表3 各組大鼠愈傷組織VEGF-A、EGF 水平比較（±s， n＝7）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與羊脂組比較，＃P＜0.05。

3.5 隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物對(duì)HFF-1、HaCaT、EA.hy926 細(xì)胞增殖活性的影響 隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物對(duì)HFF-1、HaCaT、EA.hy926 細(xì)胞活性均具有抑制作用（P＜0.01），可避免愈傷組織的過(guò)度增殖導(dǎo)致頑固性瘢痕形成，見(jiàn)圖6。隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物48 h 的IC50為HFF-1 細(xì)胞29.705 μmol／L，HaCaT 細(xì)胞2.904 μmol／L，EA.hy926 細(xì)胞11.171 μmol／L。

圖6 各組HFF-1、HaCaT、EA.hy926 細(xì)胞增殖抑制率（±s， n＝3）

3.6 隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物對(duì)HaCaT 細(xì)胞遷移率的影響 與0 μmol／L 組比較，隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物1、3 μmol／L 組16、32 h 空白面積增大（P＜0.01），即細(xì)胞遷移率降低；48 h 各組細(xì)胞均填充滿原先劃痕位置，劃痕面積為0，見(jiàn)圖7、表4。說(shuō)明隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物處理后再上皮化速率的降低，HaCaT 細(xì)胞上皮-間充質(zhì)化（EMT）水平下調(diào)，避免角質(zhì)層過(guò)早形成、增厚、堆疊，減少角蛋白、膠原纖維過(guò)度積累，在不影響創(chuàng)面愈合的前提，抑制肥厚性瘢痕組織的形成。

表4 各組HaCaT 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)空白面積比較（±s， n＝3）

表4 各組HaCaT 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)空白面積比較（±s， n＝3）

注：與0 μmol／L 組比較，*P＜0.05。

圖7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.7 隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物對(duì)3 種細(xì)胞生長(zhǎng)因子分泌的影響 3 種細(xì)胞經(jīng)0、20%、50%抑制濃度的隱丹參酮、丹參酮ⅡA 化合物處理后。隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物各濃度組劑量依賴性地升高HFF-1 細(xì)胞中VEGF-A、EGF水平（P＜0.05，P＜0.01），HaCaT 細(xì)胞中VEGF-A 水平（P＜0.01），及EA.hy926 細(xì)胞VEGF-A 水平（P＜0.01），并降低EA.hy926 細(xì)胞EGF 水平（P＜0.01），見(jiàn)圖8。

圖8 3 種細(xì)胞VEGF-A、EGF 水平（±s， n＝3）

3.8 各組愈傷組織、細(xì)胞中TGF-β1、TGF-β3、Col1 蛋白表達(dá)比較 如圖9A～9B 所示，與對(duì)照組比較，羊脂組、丹參酮軟膏組、滅瘢膏組TGF-β1、TGF-β3蛋白表達(dá)均降低（P＜0.01），說(shuō)明以羊脂為基質(zhì)能夠促進(jìn)隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物的釋放吸收，促進(jìn)混合物對(duì)TGF-β1、TGF-β3表達(dá)的抑制作用。如圖9C～9D 所示，與0 μmol／L 組比較，隱丹參酮、丹參酮ⅡA混合物各濃度組HFF-1 細(xì)胞Col1 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.01），說(shuō)明其具有抑制人皮膚成纖維細(xì)胞Col1 的活性。

圖9 各組愈傷組織、細(xì)胞中TGF-β1、TGF-β3、Col1 蛋白表達(dá)（±s， n＝3）

4 討論

滅瘢膏是一種效果顯著且使用歷史悠久的民間驗(yàn)方，HPLC 分析發(fā)現(xiàn)其中含有的主要活性成分為隱丹參酮、丹參酮ⅡA。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，丹參酮ⅡA與隱丹參酮對(duì)HFF-1 細(xì)胞活性具有抑制作用，且以丹參酮ⅡA的IC50最低，但兩者IC50均高于丹參酮混合物，故使用隱丹參酮與丹參酮ⅡA設(shè)計(jì)藥理實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明隱丹參酮與丹參酮ⅡA混合物為滅瘢膏中發(fā)揮藥理作用的主要活性成分。

瘢痕組織形成是愈傷組織過(guò)度增殖、膠原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過(guò)度積累導(dǎo)致的。膠原纖維由膠原蛋白及甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等構(gòu)成。膠原蛋白肽鏈中關(guān)鍵前肽缺失、Col1 無(wú)法重新螺旋生成膠原都會(huì)影響膠原纖維合成［14-15］。通過(guò)病理染色和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹參酮混合物可抑制Col1、膠原纖維的合成，并分解膠原纖維生成膠原蛋白以減少膠原纖維在愈傷組織中的沉積。

系統(tǒng)性皮膚硬化病、瘢痕組織增生過(guò)程中αvβ3、5 激活TGF-βmRNA 使TGF-β 表達(dá)增加［16］，TGF-β1mRNA 及其蛋白表達(dá)異常增高是正常皮膚向瘢痕組織轉(zhuǎn)化的標(biāo)志［17］；丹參酮混合物可抑制愈傷組織中TGF-β 的分泌，進(jìn)而降低TGF-β／Smad 通路中p-Smad2、p-Smad3 水平［18］，從而降低TGF-β1對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用。

藥物載體將創(chuàng)面密封降低氧量，愈傷組織受缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）的分泌提升促進(jìn)VEGF-A 編碼基因的表達(dá)從而促進(jìn)創(chuàng)面中VEGF-A 水平的提升［19-20］。滅瘢膏、丹參酮軟膏處理后生長(zhǎng)因子VEGF-A 水平在前期顯著降低并在給藥后期顯著提升，可能在前7 d 時(shí)，丹參酮通過(guò)影響HIF-1α 亞基與其輔助活化因子CBP／p300 的活化，HIF-1α、HIF-1β 的異源二聚后與缺氧反應(yīng)原（HRE）、VEGF-AR2受體結(jié)合水平降低有關(guān)［21］，前期較低的VEGF-A 水平能夠抑制愈傷組織中毛細(xì)血管的生成，從而避免愈傷組織的過(guò)度增殖而形成瘢痕組織。

本實(shí)驗(yàn)明確了滅瘢膏的主要活性成分為隱丹參酮、丹參酮ⅡA，通過(guò)動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了隱丹參酮、丹參酮ⅡA減少瘢痕組織形成的藥理作用，初步闡明了滅瘢膏在傷口愈合時(shí)期抑制愈傷組織過(guò)度增殖，減少因膠原纖維過(guò)度沉積引起的瘢痕形成的機(jī)制，為新產(chǎn)品研制和丹參植物資源的開(kāi)發(fā)利用提供了參考。