喬 進(jìn)，趙 彥，陳 霞，竇志華*，孟國(guó)梁，吳 鋒，徐濟(jì)良

（1.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院，江蘇 南通 226006； 2.南通大學(xué)，江蘇 南通 226006）

糖尿病腎病是糖尿病患者容易發(fā)生的并發(fā)癥之一，是發(fā)展為終末期腎病的主要病因，也是糖尿病患者致死的重要原因之一，大約有30%～45% 的糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)糖尿病腎?。?-2］。糖尿病腎病在臨床上缺少有效的治療方法，至今為止，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。中藥單體在糖尿病腎病的治療中發(fā)揮一定作用，如姜黃素、丹酚酸B 等［3-6］。大黃蒽醌類化合物大黃酸在降血糖、抗氧化、抗炎、抗癌等方面有重要作用［7-8］。大黃酸已被證實(shí)可通過(guò)TGF-β1／Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟發(fā)揮保護(hù)作用［9］，本研究基于PI3K／Akt／FoxO1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過(guò)構(gòu)建STZ 誘導(dǎo)的2 型糖尿病大鼠模型，從氧化應(yīng)激指標(biāo)、腎組織病理形態(tài)學(xué)及目標(biāo)蛋白表達(dá)等情況，進(jìn)一步探討大黃酸對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 試劑與藥物 大黃酸購(gòu)自上海笛柏生物科技有限公司，純度＞98.0%，批號(hào)DK05，用含0.5%羥甲基纖維素鈉（CMC）的0.9%NaCl 溶液配置成相應(yīng)劑量的混懸液；陽(yáng)性對(duì)照藥二甲雙胍購(gòu)自上海信宜天平藥業(yè)有限公司，批號(hào)67100507。鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，臨用前用0.1 mol／L 檸檬酸緩沖液配置成1% 溶液；丙二醛（MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；β-actin 抗體購(gòu)自上?？党缮锕こ逃邢薰荆籔I3K、Akt、FoxO1 抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司；預(yù)染蛋白Marker 購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs 公司；蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自海門碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器 One Touch 血糖儀（美國(guó)強(qiáng)生公司）；BH-NICB 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；蛋白電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；SH-100 型凝膠圖像分析儀（上海復(fù)旦高技術(shù)公司）。

1.3 動(dòng)物 成年SD 大鼠70 只，雌雄各半，體質(zhì)量160～180 g，飼養(yǎng)于南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2018-001，分籠飼養(yǎng)，每籠4 只，環(huán)境溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度55%～60%，飼料與水充足。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥 隨機(jī)取10 只大鼠為正常組，其余60 只為造模組。正常組大鼠給予普通飼料，造模組大鼠先給予高脂飲食（普通飼料70%、蛋黃粉5%、奶粉5%、脂肪20%）4 周后，在其胰島素抵抗后禁食12 h，給予小劑量STZ（35 mg／kg）腹腔注射。1 周后，大鼠空腹血糖值大于11.1 mmol／L，提示造模成功。取48 只造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組，大黃酸高、低劑量組（150、75 mg／kg），二甲雙胍組（300 mg／kg），每組12 只，繼續(xù)給予高脂飲食，每天給藥1 次，正常組與模型組大鼠給予0.9%NaCl 灌胃，持續(xù)12 周。

2.2 血糖測(cè)定 給藥12 周末，各組大鼠禁食12～14 h 后經(jīng)尾靜脈取血測(cè)空腹血糖。

2.3 體質(zhì)量與腎臟指數(shù)測(cè)定 給藥12 周末，取腎臟，用0.9%NaCl 溶液沖洗，濾紙吸干，稱重并計(jì)算腎臟指數(shù)，腎臟指數(shù)＝雙側(cè)腎臟質(zhì)量／大鼠體質(zhì)量×100%。

2.4 腎組織MDA 水平和SOD、GSH-Px 活性檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)各組大鼠腎臟組織中MDA 水平和SOD、GSH-Px 活性。

2.5 腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取腎臟置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，切片，行HE 與Masson 染色，通過(guò)光鏡觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)變化，拍照，每只大鼠選取5個(gè)典型視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以系膜基質(zhì)百分比為依據(jù)進(jìn)行腎小球損傷評(píng)分。

2.6 免疫組化法檢測(cè)FoxO1 蛋白表達(dá) 組織切片后進(jìn)行脫蠟，使用檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，3% 雙氧水滅活，F(xiàn)oxO1（1∶200）4 ℃孵育過(guò)夜，37 ℃復(fù)溫30 min，PBS 洗滌，二抗（1∶1 000）37 ℃孵育30 min，洗滌，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，透明，封片，采用JEDA801D 型形態(tài)學(xué)軟件測(cè)定陽(yáng)性信號(hào)的面積與平均灰度。

2.7 Western blot 法檢測(cè)PI3K、Akt 與FoxO1 蛋白表達(dá)取100 mg 腎組織，組織裂解液提取蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。用8% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，置于5%脫脂牛奶TBST 溶液中室溫封閉2 h，分別加入一抗與β-actin 抗體4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST 洗滌2 次，加二抗室溫反應(yīng)1 h，TBST 洗滌2 次后于暗室加入ECL 試劑，X 線膠片曝光顯影定影，測(cè)定各組蛋白與內(nèi)參（β-actin）條帶灰度值的比值，取平均值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠空腹血糖變化 與正常組比較，模型組大鼠空腹血糖升高（P＜0.05）；與模型組比較，大黃酸高劑量組與二甲雙胍組大鼠空腹血糖降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖比較（±s）

表1 各組大鼠空腹血糖比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05。

3.2 各組大鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量與腎臟指數(shù)變化 正常組大鼠活動(dòng)狀態(tài)良好，行動(dòng)靈敏，外表毛發(fā)整齊；模型組與大黃酸低劑量組大鼠多數(shù)安靜不動(dòng)，外表毛發(fā)臟亂；大黃酸高劑量組與二甲雙胍組大鼠活動(dòng)狀態(tài)良好，行動(dòng)靈敏，毛發(fā)色澤較光亮。與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量下降，腎臟指數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組比較，大黃酸高劑量組與二甲雙胍組大鼠體質(zhì)量升高，腎臟指數(shù)下降（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量與腎臟指數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠體質(zhì)量與腎臟指數(shù)比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

3.3 各組大鼠腎臟MDA 水平和SOD、GSH-Px 活性變化與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織MDA 水平升高，SOD、GSH-Px 活性降低（P＜0.01）；與模型組比較，大黃酸各劑量組與二甲雙胍組大鼠腎組織MDA 水平降低，SOD、GSH-Px 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），見表3。

表3 各組大鼠腎臟MDA 水平和SOD、GSH-Px 活性比較（±s）

表3 各組大鼠腎臟MDA 水平和SOD、GSH-Px 活性比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.4 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)變化 肉眼觀察正常組大鼠腎臟表面顏色為暗紅色，包膜清晰易剝離；模型組大鼠腎臟體積較大，顏色較正常組蒼白；其余給藥組大鼠腎臟外觀性狀介于正常組與模型組之間。HE 染色顯示，正常組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)清晰，間質(zhì)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠腎組織增生明顯，細(xì)胞外基質(zhì)增多；各給藥組大鼠上述病變均有不同程度改善，部分腎小球增大、系膜細(xì)胞增生等均可見不同程度改善。通過(guò)腎小球損傷指數(shù)分析，與正常組比較，模型組大鼠腎組織損傷加重（P＜0.01）；與模型組比較，大黃酸各劑量組腎組織損傷減輕（P＜0.01），見圖1～2、表4～5。

圖1 各組大鼠腎臟HE 染色圖（×100）

圖2 各組大鼠腎臟Masson 染色圖（×400）

表4 各組大鼠腎組織HE 染色腎小球損傷指數(shù)比較（±s）

表4 各組大鼠腎組織HE 染色腎小球損傷指數(shù)比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

表5 各組大鼠腎組織Masson 染色腎小球損傷指數(shù)比較（±s）

表5 各組大鼠腎組織Masson 染色腎小球損傷指數(shù)比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.5 各組大鼠腎組織FoxO1 蛋白表達(dá)變化 與正常組比較，模型組腎組織FoxO1 表達(dá)增多（P＜0.05）；與模型組比較，大黃酸高劑量組與二甲雙胍組FoxO1 表達(dá)降低（P＜0.05），見圖3、表6。

圖3 各組大鼠腎組織FoxO1 蛋白免疫組化染色圖（×400）

表6 各組大鼠腎組織FoxO1 蛋白表達(dá)比較（±s）

表6 各組大鼠腎組織FoxO1 蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.6 各組大鼠腎組織PI3K、Akt、FoxO1 蛋白表達(dá)變化與正常組比較，模型組大鼠腎組織PI3K、Akt 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），F(xiàn)oxO1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，大黃酸高劑量組與二甲雙胍組大鼠腎臟組織PI3K、Akt 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），F(xiàn)oxO1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見圖4、表7。

表7 各組大鼠腎組織PI3K、Akt、FoxO1 蛋白表達(dá)比較（±s）

表7 各組大鼠腎組織PI3K、Akt、FoxO1 蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

圖4 各組大鼠腎組織PI3K、Akt、FoxO1 蛋白條帶圖

4 討論

糖尿病腎病是糖尿病人群較重要的并發(fā)癥之一，慢性高血糖及腎小球?yàn)V過(guò)增高導(dǎo)致的蛋白尿是其主要的臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重者甚至引起腎衰竭，危及生命。微量白蛋白尿是診斷糖尿病腎病的標(biāo)志［9］。中草藥在糖尿病治療中的運(yùn)用逐年增多，在治療由糖尿病引起的各種并發(fā)癥方面有著獨(dú)特的療效。大黃酸對(duì)糖尿病大鼠的腎臟病變具有預(yù)防和保護(hù)作用［10-14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠的高血糖狀態(tài)直接影響了其腎臟的功能。氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎組織MDA 水平均升高，SOD 與GSH-Px 活性降低，提示模型大鼠腎臟可能處于氧化應(yīng)激損傷的狀態(tài)，導(dǎo)致腎臟損害。給藥干預(yù)12 周后，大黃酸高劑量組腎臟組織MDA水平降低，SOD 與GSH-Px 活性升高，提示大黃酸可減輕糖尿病對(duì)腎臟帶來(lái)的損害。

PI3K／Akt／FoxO1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑，是生物體內(nèi)調(diào)控血糖的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［15］，其通過(guò)減輕高脂、高能量飲食帶來(lái)的胰島素抵抗，促進(jìn)外周組織對(duì)葡萄糖的攝取。FoxO1 為一種多功能的蛋白，它是Forkhead 大家族中的一個(gè)蛋白亞群，在胰腺β 細(xì)胞與肝細(xì)胞中均有表達(dá)。FoxO1 可以抑制α 細(xì)胞向β 細(xì)胞轉(zhuǎn)化，保護(hù)β 細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，維持β 細(xì)胞終末分化狀態(tài)以及抑制胰腺祖細(xì)胞分化為β 細(xì)胞［16］。Akt 是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中一個(gè)重要的下游分子，活化狀態(tài)的Akt 可促進(jìn)機(jī)體葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)與糖原合成，提高機(jī)體對(duì)胰島素的敏感，發(fā)揮降糖作用。同時(shí)，活化的Akt 使FoxO1 磷酸化而失去活性，降低糖異生基因G6P 及PEPCK 水平，從而減少糖異生，使血糖降低［17］。當(dāng)2 型糖尿病患者體內(nèi)胰島素受體表達(dá)降低，干擾PI3K 活化，間接影響Akt 的活化，出現(xiàn)血糖升高。當(dāng)PI3K／Akt／FoxO1 信號(hào)通路上任何一個(gè)因子代謝出現(xiàn)異常均可導(dǎo)致體內(nèi)的胰島素抵抗，極有可能誘發(fā)2 型糖尿?。?8-19］。通過(guò)腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察，模型組大鼠腎組織增生明顯，細(xì)胞外基質(zhì)增多；而各給藥組大鼠腎小球增大、腎小球系膜細(xì)胞增生等病變有所改善，其中以大黃酸高劑量組最為明顯。大黃酸高劑量組與二甲雙胍組大鼠腎臟組織PI3K 與Akt 表達(dá)升高，F(xiàn)oxO1 表達(dá)降低，表明其可能通過(guò)干預(yù)腎臟PI3K／Akt／FoxO1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低血糖，保護(hù)腎臟。