馮衛(wèi)紅，姚 瀾，呂建華，潘美晨，范冬雨，李長田

（吉林農業(yè)大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118）

元蘑Sarcomyxa edulis（Y.C.Dai，Niem el? ＆ G.F.Qin）T.Saito，T.Tonouchi ＆ T.Harada 隸屬于真菌界Fungi，擔子菌門Basidiomycota，蘑菇綱Agaricomycetes，蘑菇目Agaricales，小菇科Mycenaceae，美味扇菇屬Sarcomyxa［1-5］，又名亞側耳［6-7］、凍蘑及黃蘑，在東北地區(qū)也叫冬蘑和美味冬菇，是東北的重要栽培菇，地位僅次于猴頭菇和黑木耳，其形態(tài)似靈芝，顏色偏黃，也叫“黃靈菇”［8］。元蘑口感好，含有大量蛋白質、氨基酸、維生素和礦物質等營養(yǎng)元素［9-11］，此外其還具有預防動脈硬化、提高機體免疫力、抑制腫瘤增殖等作用［12-14］。酒中放元蘑后直接飲用，有一定藥用價值［15］。元蘑生物活性高，國內外對其多糖在抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等方面作用比較關注［16-18］，對其藥用價值也較為重視［19-20］。因此，本研究探討了元蘑菌絲發(fā)酵多糖對環(huán)磷酰胺造成免疫損傷小鼠的保護作用。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級昆明小鼠，4 周齡，體質量18～22 g，由四平市鐵西區(qū)愛普隆生物科技經銷處提供。

1.2 儀器 H2100R 型高速冷凍離心機（蘇州優(yōu)格曼機械有限公司）；YW-SYS-20L 型生化培養(yǎng)箱（揚州市培英試驗儀器有限公司）；352 型酶標儀（芬蘭Labsystems 公司）；Milli-Q 型超純水機（美國Millipore 公司）。

1.3 元蘑發(fā)酵液多糖 元蘑菌株SE1（編號HMJAU 2016092521），由吉林農業(yè)大食藥用菌教育部工程研究中心提供。菌種活化發(fā)酵均采用cPDA 培養(yǎng)基，將長勢好的液體菌種按10%左右的接種量接入cPDA 培養(yǎng)基，25 ℃、150 r／min 進行發(fā)酵培養(yǎng)12 d。將發(fā)酵到多糖含量較高時期的發(fā)酵液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，溫度60 ℃，多糖-乙醇比為1∶4，過濾后加入無水乙醇。將沉淀的多糖放入50 ℃烘箱進行烘干，得到粗多糖。

2 方法

2.1 造模及分組給藥 60 只小鼠適應性飼養(yǎng)1 周，隨機分為空白組、模型組、陽性組（0.02 mL／kg 黃芪精口服液）和元蘑多糖低、中、高劑量組（50、100、200 mg／kg），給藥組灌胃給予相應劑量藥物，空白組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，第5 天灌胃結束后，連續(xù)3 d 腹腔注射80 mg／kg環(huán)磷酰胺以建立免疫抑制小鼠模型，空白組腹腔注射等體積生理鹽水，并繼續(xù)灌胃給藥12 d。

2.2 ELISA 法檢測血清細胞因子水平 灌胃結束后，小鼠稱定體質量，眼球取血，3 000 r／min 離心10 min，分離得上層血清，按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清IL-6、IL-1β、TNF-α 水平，用酶標儀于492 nm 波長處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算IL-6、IL-β、TNF-α 水平。

2.3 小鼠胸腺和脾臟指數(shù)計算 小鼠處死后用75%酒精消毒5 min，沿腹部正中線剖腹并取出胸腺和脾臟，去除筋膜組織，漂洗后吸干水分稱重，以胸腺或脾臟質量和體質量的比值表示胸腺和脾臟指數(shù)。

2.4 小鼠脾臟淋巴細胞增殖檢測 各組小鼠脾臟放入有200 目篩網的平板內，用1.5 mL RPMI-1640 培養(yǎng)基沖洗研磨，細胞懸液裝入1.5 mL 離心管，1 500 r／min 離心5 min，紅細胞裂解液重復裂解2 次，離心后用培養(yǎng)基洗滌，沉淀重懸于2 mL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，臺盼藍染色后調整各組細胞密度至1×106／mL，接種于96 孔板，每孔100 μL，再加100 μL ConA 溶液；另設對照孔，僅加200 μL 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，MTT 法檢測OD570值，計算各組脾臟淋巴細胞增殖率。

2.5 糞便氨含量檢測 參考文獻［21-22］報道，用靛酚藍比色法測定糞便氨含量。取約50 mg 結腸糞便樣品，加NH4＋溶解液和蛋白沉淀液各500 μL，混勻，5 000 r／min 離心2 min，取200 μL 上清液加入含3.8 mL 超純水的試管中，即樣品溶液。96 孔板每孔加入200 μL 樣品溶液，每組設3 個復孔，對照液（僅無糞便，其他添加溶液同樣品液）調零，用酶標儀測定樣品液吸光度值，根據(jù)糞便質量、稀釋倍數(shù)等換算關系計算糞便樣品中的氨含量，以μmol／g 糞便表示。

2.6 HE 和AB-PAS 染色觀察小腸組織病理結構 取小鼠小腸組織，經固定、脫水、包埋、切片后，行常規(guī)HE 和AB-PAS 染色，觀察小腸組織病理形態(tài)及杯狀細胞數(shù)量［23-24］。

2.7 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 26 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 元蘑菌絲發(fā)酵多糖對免疫抑制小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響 胸腺調節(jié)免疫器官、免疫細胞［25］；脾臟產生免疫應答，合成活性物質［26］。表1 顯示，與空白組比較，模型組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)均降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，元蘑多糖低劑量組小鼠脾臟指數(shù)升高（P＜0.05）。

表1 各組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)比較（±s， n＝10）

表1 各組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)比較（±s， n＝10）

注：與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 元蘑菌絲發(fā)酵多糖對免疫抑制小鼠細胞因子水平的影響 細胞因子一般可分為Th1、Th2、Th17、Treg4 種類型，Th2 型主要協(xié)助合成抗體［27］，IL-1β 可以誘發(fā)炎癥反應及調節(jié)多種免疫功能［27-28］。表2 顯示，與空白組比較，模型組小鼠血清IL-6 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，元蘑多糖高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均升高（P＜0.05，P＜0.01），中劑量組IL-6 水平升高（P＜0.01）。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（±s， n＝10）

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（±s， n＝10）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 元蘑菌絲發(fā)酵多糖對免疫抑制小鼠脾臟淋巴細胞增殖的影響 表3 顯示，與模型組比較，元蘑多糖各劑量組和陽性組對ConA 誘導小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力有一定促進作用（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

表3 各組小鼠脾臟淋巴細胞增殖率比較（±s， n＝10）

表3 各組小鼠脾臟淋巴細胞增殖率比較（±s， n＝10）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

3.4 元蘑菌絲發(fā)酵多糖對免疫抑制小鼠糞便氨含量的影響 表4 顯示，模型組小鼠糞便氨含量高于空白組（P＜0.05）；元蘑多糖高、中劑量組小鼠糞便氨含量低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 各組小鼠糞便氨含量比較（±s， n＝10）

表4 各組小鼠糞便氨含量比較（±s， n＝10）

注：與空白組比較，△P ＜0.05；與模型組比較，* P ＜0.05，**P＜0.01。

3.5 元蘑菌絲發(fā)酵多糖對免疫抑制小鼠小腸組織病理結構的影響 HE 染色結果如圖1 所示，空白組小鼠小腸絨毛排列整齊，上皮細胞柱形，組織結構清晰；模型組小腸組織明顯腫狀，絨毛變短萎縮甚至斷裂脫落；與模型組比較，元蘑多糖組小腸組織在形態(tài)結構上有一定的改善，絨毛長度及數(shù)量均高于模型組；另外，環(huán)磷酰胺及元蘑多糖對腸壁厚度均無明顯影響。

圖1 各組小腸組織HE 染色圖

AB-PAS 染色結果如圖2 所示，小腸組織結構形態(tài)與HE 染色結果大致相同，空白與陽性組小腸絨毛相對更完整，數(shù)量更多，排列整齊，組織結構也更清晰；與空白組比較，模型組杯狀細胞數(shù)（藍染）減少；與模型組比較，元蘑多糖組杯狀細胞數(shù)增多。

圖2 各組小腸組織AB-PAS 染色圖

4 討論

元蘑是珍貴的食藥用菌，生物活性較高，其中具有生物活性化合物主要是多糖類，多糖的生物活性范圍較廣，是生命活動所需的基本物質，主要存在于元蘑子實體及菌絲體發(fā)酵液中。據(jù)報道，食用菌多糖能提高巨噬細胞的吞噬能力，具有調節(jié)免疫能力。除多糖類化合物外還有三萜類化合物、麥角甾醇、礦物質元素、黃酮類化合物等。食藥用菌的三萜類化合物在自然界中大量存在，在純天然物質中占比較大，可以用于保肝、鎮(zhèn)痛、消炎、抑菌以及防治心腦血管疾病等［29］。食用菌對金屬元素有富集的能力，吳英等［30］研究發(fā)現(xiàn)，食用菌中含有很多對人體有益的礦物質，且富集大量的鍺和硒。食用菌黃酮類化合物具有神經保護、抗病毒、抗氧化以及抗癌等多種活性?？婂X江等［31］針對4 種食用菌進行實驗研究，發(fā)現(xiàn)食用菌子實體中的總黃酮含量較髙，平菇黃酮含量最髙，且抗腫瘤活性最強，能夠直接殺傷MCF7 細胞，秀珍菇抗氧化能力最強。

免疫抑制模型有3 種制備方式，一是使用免疫抑制劑致使免疫力低下，二是輻射誘導免疫低下，三是強電流刺激引起免疫低下［32］。本研究采用環(huán)磷酰胺注射誘導免疫低下模型，該模型穩(wěn)定，免疫抑制效果明顯，且不會危及小鼠生命。本文就元蘑多糖的藥理活性進行了初步研究探討，發(fā)現(xiàn)元蘑多糖可提高免疫抑制小鼠的細胞因子水平，尤其是對IL-6 的提高更為明顯，可改善脾臟指數(shù)，促進脾臟淋巴細胞增殖，其中多糖高劑量組糞便氨含量低于模型組，對受損小鼠小腸組織形態(tài)結構具有改善作用。

綜上所述，元蘑菌絲發(fā)酵多糖可提高環(huán)磷酰胺免疫損傷小鼠的免疫功能。