趙綺悅高曉萌劉令今劉子騫陳格格許慶友

（1.河北中醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，河北 石家莊 050091； 2.河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050091； 3.河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，河北 石家莊 050091）

目前，梗阻性腎病在我國(guó)農(nóng)村慢性腎臟病中發(fā)病率居首位［1］，可表現(xiàn)為雙側(cè)或單側(cè)梗阻，單側(cè)梗阻進(jìn)展為腎衰竭與對(duì)側(cè)腎臟的失代償有關(guān)。既往研究表明，單側(cè)腎梗阻刺激醛固酮的過度分泌，激活鹽皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)另一側(cè)腎損傷［2］，課題組研究也發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞-肌成纖維化轉(zhuǎn)變也參與這一過程。腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化與鈉氯協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NCC）的過表達(dá)、醛固酮誘導(dǎo)的組織缺血缺氧有關(guān)［3-4］，低氧誘導(dǎo)因子刺激轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）分泌增多會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化［5］。

補(bǔ)虛解毒化瘀方是本課題組多年來用于治療慢性腎臟病的經(jīng)驗(yàn)方，前期研究已經(jīng)證實(shí)該方具有改善梗阻性腎病對(duì)側(cè)腎臟腎小球硬化，減緩腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展的作用［6］。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察該方調(diào)控NCC／HIF-1α 信號(hào)通路對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠對(duì)側(cè)腎臟小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用，以期為中醫(yī)藥防治慢性腎臟病提供新思路。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD 大鼠，7 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（冀）2018-004。大鼠飼養(yǎng)在12 h／12 h 光暗循環(huán)、溫度（22±1）℃的房間，可自由獲取食物和水。

1.2 儀器 RM2245 型石蠟切片機(jī)、CTS SP8 型激光共聚焦掃描顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；ODYSSEY 雙色紅外激光成像掃描儀（美國(guó)LI-COR 公司）；半干轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；VANOX DM-10AD 型顯微照相儀（日本Olympus 公司）。

1.3 試劑與藥物 補(bǔ)虛解毒化瘀方由生黃芪20 g（批號(hào)403196T）和地龍（批號(hào) 6033291）、醋鱉甲（批號(hào)6013581）、赤芍（批號(hào)311400T）、黃芩（批號(hào)6033511）、金銀花（批號(hào)6020961）各10 g 組成，均為廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)的免煎顆粒。依普利酮（批號(hào)2543009，輝瑞公司生產(chǎn)），由日本國(guó)際醫(yī)療福祉大學(xué)下澤達(dá)雄教授惠贈(zèng)，由日本Research Diets Inc 公司根據(jù)動(dòng)物攝食量和100 mg／kg 藥物劑量以1.25 g／kg 的比例添加到飼料中［7-8］。SGK-1 抗 體（美 國(guó) Affinity Biosciences 公 司，批號(hào)86018726）；NCC、HIF-1α、Vimentin、α-SMA、β-actin 抗體（英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)GR3274565-3、GR3319739-1、GR3186827-16、GR3252482-10、GR305367-39）；TGF-β1 抗體（美國(guó)Bioworld 公司，批號(hào)AA56133）；GAPDH 抗體（美國(guó)Epitomics 公司，批號(hào)Y123103P）。

2 方法

2.1 造模方法及給藥 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、依普利酮組和中藥組，每組各10 只。采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎法建立梗阻性腎病模型，大鼠吸入異氟烷麻醉后，分離左側(cè)輸尿管，于輸尿管上1／3 與下1／3 處結(jié)扎并剪斷中1／3 處輸尿管，縫合皮膚；假手術(shù)組僅游離輸尿管。單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后，依普利酮組每天給予含有依普利酮的加工飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，中藥組按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)》［9］劑量換算方法給予中藥免煎顆粒，按1.92 g／kg（相當(dāng)于11.7 g／kg生藥量）劑量加到3 mL 蒸餾水中，每天灌胃1 次，藥物干預(yù)10 d 后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，股動(dòng)脈取血，摘取梗阻對(duì)側(cè)的腎臟（右側(cè)腎臟），沿縱軸切開，一部分組織于4%多聚甲醛固定，石蠟或OCT 包埋，用于組織病理學(xué)的檢測(cè)；另一部分放入液氮中快速凍存，隨即置于－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜跈z測(cè)相關(guān)蛋白指標(biāo)。

2.2 對(duì)側(cè)腎組織Masson 染色及免疫組化檢測(cè) 常規(guī)制備腎組織病理切片，Masson 染色觀察腎組織病理改變；免疫組化檢測(cè)α-SMA、Vimentin、SGK-1、HIF-1α、TGF-β1 表達(dá)。大鼠腎組織進(jìn)行免疫組化染色后，以間質(zhì)中棕色黃染部分為陽性表達(dá)，SGK-1 和HIF-1α 在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，采用Image Pro Plus 軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析［6］，計(jì)算陽性表達(dá)面積與腎組織總面積的比值，取平均值。

2.3 免疫熒光法檢測(cè)NCC 表達(dá) 大鼠腎組織進(jìn)行免疫熒光染色后，以綠色熒光為陽性表達(dá)，采用Image Pro Plus 軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析，計(jì)算陽性表達(dá)面積與腎組織總面積的比值，取平均值。

2.4 Western blot 法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 取新鮮腎臟組織100 mg 于400 μL 含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的裂解液中進(jìn)行勻漿，4 ℃、16 000×g離心15 min 后收集上清液，測(cè)定蛋白濃度，用10% SDS-PAGE 凝膠分離50 μg 蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌，分別與相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，TBST 洗滌，用Odyssey 紅外顯影儀掃描顯影，采集圖像，測(cè)量目的蛋白灰度值，并與所得內(nèi)參進(jìn)行比較。

2.5 RT-qPCR 法檢測(cè)腎臟組織中SGK-1、TGF-β1 mRNA 表達(dá) 按照RNA 提取試劑盒說明書提取各組腎組織的總RNA，并采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用PCR 試劑盒檢測(cè)SGK-1、TGF-β1 mRNA 表達(dá)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用2－ΔΔCT法計(jì)算SGK-1、TGF-β1 mRNA 相對(duì)表達(dá)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 25.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD／SNK 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)虛解毒化瘀方對(duì)大鼠腎組織病理學(xué)改變的影響Masson 結(jié)果顯示，假手術(shù)組腎臟腎間質(zhì)中僅含有少量纖維成分，且結(jié)構(gòu)清晰；模型組腎間質(zhì)膠原成分較假手術(shù)組增多（P＜0.01）；中藥組和依普利酮組腎間質(zhì)膠原成分均少于模型組（P＜0.01）。免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，假手術(shù)組α-SMA 僅在血管中表達(dá)，而在腎間質(zhì)和上皮細(xì)胞中未見表達(dá)；Vimentin 表達(dá)可見于部分遠(yuǎn)端小管間質(zhì)。與假手術(shù)組比較，模型組α-SMA 表達(dá)增加（P＜0.01），以遠(yuǎn)端腎小管和腎間質(zhì)表達(dá)最為明顯；Vimentin 表達(dá)增加（P＜0.01），見于遠(yuǎn)端小管胞質(zhì)及腎間質(zhì)。與模型組比較，中藥組和依普利酮組α-SMA 局部中度表達(dá)，間質(zhì)少量表達(dá)，較模型組降低（P＜0.01）；Vimentin 在腎小管間質(zhì)有表達(dá)，較模型組降低（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠對(duì)側(cè)腎組織病理變化及α-SMA、Vimentin 表達(dá)（±s， n＝3）

3.2 補(bǔ)虛解毒化瘀方對(duì)大鼠腎組織α-SMA、Vimentin 蛋白表達(dá)的影響 圖2 顯示，模型組α-SMA、Vimentin 蛋白表達(dá)均較假手術(shù)組升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組和依普利酮組α-SMA、Vimentin 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠對(duì)側(cè)腎組織α-SMA、Vimentin 蛋白表達(dá)（±s， n＝3）

3.3 補(bǔ)虛解毒化瘀方對(duì)大鼠腎組織NCC 表達(dá)的影響 圖3顯示，假手術(shù)組NCC 陽性表達(dá)分布在腎遠(yuǎn)曲小管管腔親水側(cè)；模型組腎遠(yuǎn)端小管細(xì)胞NCC 表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.01），亦可見于近端小管；與模型組比較，中藥組和依普利酮組NCC 表達(dá)范圍和強(qiáng)度均降低（P＜0.01）。圖4 顯示，模型組NCC 蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組（P＜0.01）；中藥組和依普利酮組NCC 蛋白表達(dá)低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 各組大鼠對(duì)側(cè)腎組織NCC 表達(dá)（±s， n＝3）

圖4 各組大鼠對(duì)側(cè)腎組織NCC 蛋白表達(dá)（±s， n＝3）

3.4 補(bǔ)虛解毒化瘀方對(duì)大鼠腎組織SGK-1、HIF-1α、TGFβ1 表達(dá)的影響 圖5 顯示，假手術(shù)組HIF-1α 僅表達(dá)于腎小管中，主要見于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；TGF-β1 主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，呈弱表達(dá)。模型組SGK-1 表達(dá)高于假手術(shù)組（P＜0.01），其表達(dá)主要在遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中；除腎小管和腎小球外，HIF-1α 表達(dá)較假手術(shù)組增加（P＜0.01），腎小管可見大量核染色，呈棕黃色顆粒；TGF-β1 表達(dá)高于假手術(shù)組（P＜0.01），以近曲小管尤為明顯。中藥組和依普利酮組SGK-1 表達(dá)強(qiáng)度及范圍較模型組減弱（P＜0.01）；HIF-1α 在腎小管染色較少，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，較模型組減弱（P＜0.01）；TGF-β1 表達(dá)范圍及強(qiáng)度較模型組減弱（P＜0.01）。

圖5 各組大鼠對(duì)側(cè)腎組織SGK-1、HIF-1α、TGF-β1 表達(dá)比較（±s， n＝3）

圖6 顯示，模型組SGK-1、HIF-1α、TGF-β1 蛋白表達(dá)均較假手術(shù)組升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，中藥組和依普利酮組SGK-1、HIF-1α、TGF-β1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 各組大鼠對(duì)側(cè)腎組織SGK-1、HIF-1α、TGF-β1 蛋白表達(dá)（±s， n＝3）

3.5 補(bǔ)虛解毒化瘀方對(duì)大鼠腎組織SGK-1、TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響 模型組SGK-1、TGF-β1 mRNA 表達(dá)高于假手術(shù)組（P＜0.01）；中藥組和依普利酮 組SGK-1、TGF-β1 mRNA 表達(dá)低于模型組（P＜0.01），見表2。

表2 各組大鼠對(duì)側(cè)腎組織SGK-1、 TGF-β1 mRNA 表達(dá)比較（±s， n＝4）

表2 各組大鼠對(duì)側(cè)腎組織SGK-1、 TGF-β1 mRNA 表達(dá)比較（±s， n＝4）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

4 討論

近年來，慢性腎臟病發(fā)病率明顯升高，已經(jīng)成為全球關(guān)注的公共性問題［1］。國(guó)內(nèi)學(xué)者列隊(duì)分析177 例梗阻性腎病患者，有25 例在18 個(gè)月的隨訪期間進(jìn)展成為終末期腎病，且有些梗阻性腎病患者即便通過外科手術(shù)解除了梗阻癥狀，術(shù)后腎功能并未見到明顯改善［10］?；谏窠?jīng)-體液代謝失常，梗阻因素刺激醛固酮分泌增多激活鹽皮質(zhì)激素受體、上調(diào)NCC 表達(dá)參與對(duì)側(cè)腎臟的損傷可能為單側(cè)腎臟損傷誘導(dǎo)慢性腎衰竭的機(jī)制［2］。

NCC 是醛固酮調(diào)節(jié)鈉排泄的主要靶點(diǎn)［11］，在鹽敏感性高血壓的形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，高鹽及醛固酮刺激可增強(qiáng)其表達(dá)［12］。梗阻性腎病模型可誘導(dǎo)醛固酮水平升高，循環(huán)至對(duì)側(cè)腎臟，激活MR／NCC 通路導(dǎo)致水鈉潴留引起組織水腫，導(dǎo)致對(duì)側(cè)腎臟的低氧損傷而發(fā)生一系列病理生理改變［13］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組NCC 及HIF-1α 表達(dá)上調(diào)，給予中藥及醛固酮受體阻斷劑治療后，NCC 及HIF-1α 的表達(dá)均有所下調(diào)。

腎小管上皮細(xì)胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）是腎臟纖維化最為常見的病理改變，有效抑制其轉(zhuǎn)化可減緩腎臟病的進(jìn)展［14］。既往研究多關(guān)注梗阻側(cè)小管上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，本研究以對(duì)側(cè)腎臟為對(duì)象，研究單側(cè)腎臟損傷誘導(dǎo)慢性腎衰竭的部分機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠對(duì)側(cè)腎臟上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志物α-SMA 及Vimentin 表達(dá)增強(qiáng)，經(jīng)依普利酮及中藥治療后，細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化減輕。

基于中醫(yī)整體觀念及治未病理論，一臟受損可及他臟，單側(cè)腎臟損傷日久可以導(dǎo)致對(duì)側(cè)腎臟受損。本課題結(jié)合慢性腎臟病的臨床辯證規(guī)律和前期研究基礎(chǔ)，以慢性腎臟病“虛、瘀、毒” 病機(jī)為依據(jù)，確立補(bǔ)虛解毒化瘀中藥組方。方中黃芪既能補(bǔ)肺固表，防止外邪直中入腎，又可補(bǔ)后天以養(yǎng)先天之腎精；金銀花、黃芩清熱解毒，現(xiàn)代藥理研究亦表明二者具有明顯的抗炎作用［15-16］；赤芍、地龍、醋鱉甲活血祛瘀，軟堅(jiān)散結(jié)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明補(bǔ)益類、活血類、解毒類中藥均有改善腎間質(zhì)纖維化的作用［17-18］。一方面，黃芪益氣補(bǔ)虛，推動(dòng)氣血正常運(yùn)行；另一方面配伍金銀花、黃芩清熱解毒，赤芍、地龍、醋鱉甲軟堅(jiān)散結(jié)，祛瘀利水，共奏補(bǔ)虛解毒、祛瘀通絡(luò)之功，從而起到治療梗阻因素介導(dǎo)的損傷同時(shí)預(yù)防其他臟器因之發(fā)生病變的作用。

綜上所述，補(bǔ)虛解毒化瘀方通過調(diào)控NCC／ HIF-1α 信號(hào)通路，抑制大鼠腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，抑制Vimentin 及α-SMA 分泌，減緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展。

致謝本實(shí)驗(yàn)主要在河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，在此衷心感謝實(shí)驗(yàn)室全體師生的幫助！