孫 洋，王洪新

（錦州醫(yī)科大學(xué)心腦血管藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121001）

肺動(dòng)脈高壓的特征是血管過(guò)度收縮和閉塞性血管重塑，其組織病理學(xué)特征包括肺血管的內(nèi)膜和外膜層增厚，以及血管閉塞和叢狀病變［1-2］，研究表明，在其肺血管系統(tǒng)和右心室中，炎癥因子水平有所增加［3］，提示炎癥在肺動(dòng)脈高壓中發(fā)揮著重要作用。NLRP3 炎性小體是一種多蛋白促炎復(fù)合物，由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）和位于細(xì)胞質(zhì)中的caspase-1 組成［4］。在肺動(dòng)脈高壓大鼠的肺組織中，NF-κB 的表達(dá)增加，此外，終末期特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者的肺血管中NF-κB 也被激活，這說(shuō)明NF-κB 的激活可能促進(jìn)了該疾病的發(fā)展［5］。

黃芪是我國(guó)傳統(tǒng)珍貴藥材，具有抗菌、止汗、消炎、利尿和滋補(bǔ)的作用，皂苷、類(lèi)黃酮和多糖等成分被認(rèn)為是黃芪的主要活性成分［6］。黃芪甲苷是從黃芪中提取的四環(huán)三萜皂苷，對(duì)多種心血關(guān)疾病具有保護(hù)作用［7］，已有研究表明，黃芪甲苷對(duì)肺動(dòng)脈高壓具有保護(hù)作用［8］，但具體改善機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)和體外水平上，分別探討黃芪甲苷對(duì)肺動(dòng)脈高壓的保護(hù)作用和潛在機(jī)制。

1 材料

1.1 試劑與藥物 黃芪甲苷（純度≥98.0%，南京景竹生物科技有限公司）。野百合堿、炎癥小體NLRP3 抑制劑MCC950、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 抑制劑Bay11-7082（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào) 315220、538120、B5556）；GAPDH、NLRP3、NF-κB 抗體（美國(guó)Proteintech 公司，貨號(hào)60004-1-Ig、19771-1-AP、14220-1-AP）；FITC 熒光染料（北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司，貨號(hào)CSB-L05598m）；Alexa Fluor 488 熒光二抗、BeyoClickTMEdU-488 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)A0423、C0071S）。

1.2 儀器 半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；NM-9602G 型酶標(biāo)分析儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；DMI3000B 型顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；制冰機(jī)（日本大阪松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社）。

1.3 動(dòng)物和細(xì)胞 健康雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量（200±10）g，由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（遼）2014-0004。人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HPAECs），購(gòu)自通派（上海）生物科技有限公司。

2 方法

2.1 分組和給藥 將60 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、MCC950 組（10 mg／kg）、Bay11-7082 組（5 mg／kg）、黃芪甲苷組（40、80 mg／kg），通過(guò)單次腹腔注射野百合堿建立肺動(dòng)脈高壓模型，黃芪甲苷組大鼠連續(xù)灌胃40、80 mg／kg黃芪甲苷28 d，MCC950 組（10 mg／kg）和Bay11-7082 組（5 mg／kg）大鼠腹腔注射相應(yīng)劑量藥物。

HPAECs 細(xì)胞在含10%胎牛血清的ECM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。HPAECs 細(xì)胞用野百合堿吡咯誘導(dǎo)24 h，然后用MCC950（10 μmol／L）、Bay 11-7082（10 μg／mL）、黃芪甲苷（50、100 μmol／L）分別處理30 min。

2.2 右心室導(dǎo)管插管法檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué) 使用BL-420S 生物信號(hào)采集和分析系統(tǒng)，通過(guò)右心室導(dǎo)管插管測(cè)定右心室收縮壓和平均肺動(dòng)脈壓。分別測(cè)定左心室壁（LV）、室間隔（S）和右心室壁（RV），右心肥厚指數(shù)表示為右心室與左心室加上隔膜的重量比，公式為右心肥厚指數(shù)＝RV／（LV＋S）。

2.3 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清TNF-α 水平以及HPAECs 細(xì)胞IL-6、TNF-α 水平 按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定大鼠血清TNF-α 水平以及HPAECs 細(xì)胞IL-6、TNF-α 水平。

2.4 免疫組化法檢測(cè)大鼠肺組織IL-6 蛋白表達(dá) 4%多聚甲醛固定肺組織，石蠟包埋，切片，經(jīng)熱修復(fù)、封閉后，IL-6 抗體4 ℃孵育過(guò)夜，滴加二抗，DAB 顯色，蘇木素染核，透明后中性樹(shù)脂封片。在顯微鏡下觀察到有棕黃色顆粒沉淀即為IL-6 表達(dá)，通過(guò)Image-Pro Plus 軟件進(jìn)行分析，蛋白表達(dá)為陽(yáng)性表達(dá)面積／總細(xì)胞面積。

2.5 免疫熒光法檢測(cè)大鼠肺組織NLRP3、NF-κB 蛋白表達(dá) 4%多聚甲醛固定肺組織，石蠟包埋，高壓抗原修復(fù)，滴加NLRP3、NF-κB 一抗，4 ℃過(guò)夜后滴加熒光二抗，DAPI 染核，在熒光倒置顯微鏡下觀察，通過(guò)Image-Pro Plus 軟件進(jìn)行分析，蛋白表達(dá)為熒光光密度總和／面積總和。

2.6 EdU-488 增殖試劑盒檢測(cè)HPAECs 細(xì)胞增殖情況 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，通過(guò)Image-Pro Plus 軟件進(jìn)行分析，細(xì)胞增殖率為EdU-488 光密度總和／面積總和。

2.7 Western blot 法檢測(cè)HPAECs 細(xì)胞NLRP3、NF-κB 蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白后BCA 法測(cè)定濃度，將樣品蛋白通過(guò)SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，封閉1.5 h，然后與NLRP3、NF-κB 抗體4 ℃孵育過(guò)夜，與二抗室溫孵育2 h，ECL 法顯色，曝光，用Image J 軟件分析結(jié)果。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 25.0 軟件進(jìn)行處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪甲苷對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠血流動(dòng)力學(xué)和體質(zhì)量的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠右心肥厚指數(shù)、右心室收縮壓和平均肺動(dòng)脈壓均升高（P＜0.01），體質(zhì)量降低（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組大鼠右心肥厚指數(shù)、右心室收縮壓和平均肺動(dòng)脈壓均降低（P＜0.01），體質(zhì)量升高（P＜0.01），說(shuō)明黃芪甲苷對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠的肺動(dòng)脈高壓有改善作用，見(jiàn)圖1。

圖1 黃芪甲苷對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠血流動(dòng)力學(xué)和體質(zhì)量的影響（±s， n＝6，1 mmHg＝0.133 kPa）

3.2 黃芪甲苷對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠血清TNF-α 水平和肺組織IL-6 表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TNFα 水平和肺組織IL-6 表達(dá)均升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組大鼠血清TNF-α 水平和肺組織IL-6 表達(dá)均降低（P＜0.01），說(shuō)明黃芪甲苷能夠減輕肺動(dòng)脈高壓大鼠炎癥反應(yīng)，見(jiàn)圖2。

圖2 黃芪甲苷對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠血清TNF-α 水平和肺組織IL-6 表達(dá)的影響（±s， n＝6）

3.3 黃芪甲苷對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠NF-κB／NLRP3 信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織NLRP3、NFκB 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組大鼠肺組織NLRP3、NFκB 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.01），說(shuō)明黃芪甲苷對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠的保護(hù)作用可能通過(guò)抑制NF-κB／NLRP3 信號(hào)通路，見(jiàn)圖3。

圖3 黃芪甲苷對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠NF-κB／NLRP3 信號(hào)通路的影響（±s， n＝6，×400）

3.4 黃芪甲苷對(duì)HPAECs 細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組比較，模型組HPAECs 細(xì)胞增殖率升高（P＜0.01）；與模型組比較較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組HPAECs 細(xì)胞增殖率降低（P＜0.01），說(shuō)明黃芪甲苷能改善HPAECs 細(xì)胞增殖情況，見(jiàn)圖4。

圖4 黃芪甲苷對(duì)HPAECs 細(xì)胞增殖的影響（±s， n＝6，×400）

3.5 黃芪甲苷對(duì)HPAECs 細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6 水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組HPAECs 細(xì)胞TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.01）；與模型組比較較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組HPAECs 細(xì)胞TNF-α、IL-6 水平降低（P＜0.01），見(jiàn)圖5。

圖5 黃芪甲苷對(duì)HPAECs 細(xì)胞TNF-α、IL-6 水平的影響（±s， n＝6）

3.6 黃芪甲苷對(duì)HPAECs 細(xì)胞NF-κB／NLRP3 信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組比較，模型組HPAECs 細(xì)胞NF-κB、NLRP3 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組、MCC950 組和Bay11-7082 組HPAECs 細(xì)胞NF-κB、NLRP3 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），見(jiàn)圖6。

圖6 黃芪甲苷對(duì)HPAECs 細(xì)胞NF-κB／NLRP3 信號(hào)通路的影響（±s， n＝6）

4 討論

野百合堿可引起肺動(dòng)脈高壓，單次腹腔注射可建立肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型。在細(xì)胞色素P-450（CYP3A4）的作用下，野百合堿在肝臟代謝為吡咯烷（野百合堿吡咯），選擇性地?fù)p傷肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，最終引起肺動(dòng)脈高壓［9］。內(nèi)皮細(xì)胞增殖和炎癥參與了肺動(dòng)脈高壓疾病發(fā)展的進(jìn)程［10］。臨床前研究和人體試驗(yàn)表明，炎癥在肺動(dòng)脈高壓中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞炎癥因子水平的升高與肺動(dòng)脈高壓患者不良預(yù)后有關(guān)［11］，在肺動(dòng)脈高壓患者的血清中，TNF-α、IL-6 水平升高［12-13］；在肺動(dòng)脈高壓大鼠的肺組織中，NF-κB表達(dá)增加，而NF-κB 的激活可能促進(jìn)了該疾病的發(fā)展［14］。NF-κB 的活化能激活NLRP3 炎性小體，并能誘導(dǎo)NLRP3和pro-IL-1β 的轉(zhuǎn)錄［13］，研究證實(shí)，NLRP3 在肺動(dòng)脈高壓起著重要作用，參與了肺動(dòng)脈高壓的疾病發(fā)展［15］。由此推測(cè)黃芪甲苷可能通過(guò)NF-κB／NLRP3 信號(hào)通路來(lái)減輕肺動(dòng)脈高壓大鼠的炎癥反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪甲苷組能夠降低肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室收縮壓、平均肺動(dòng)脈壓和右心肥厚指數(shù)，改善肺動(dòng)脈高壓大鼠體質(zhì)量降低情況，說(shuō)明黃芪甲苷可以改善肺動(dòng)脈高壓大鼠血流動(dòng)力學(xué)和生活質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可以改善HPAECs 細(xì)胞的增殖情況，下調(diào)肺動(dòng)脈高壓大鼠血清、肺組織和HPAECs 細(xì)胞中IL-6、TNF-α 水平和NFκB、NLRP3 表達(dá)，說(shuō)明黃芪甲苷可在體內(nèi)和體外減輕野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠或HPAECs 細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，與模型組比較，MCC950 組和Bay11-7082組IL-6、TNF-α 水平和NF-κB、NLRP3 蛋白表達(dá)降低，提示MCC950 和Bay11-7082 能夠減輕肺動(dòng)脈高壓大鼠和HPAECs 細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)，并且這種作用與黃芪甲苷類(lèi)似。

綜上所述，黃芪甲苷能夠減輕肺動(dòng)脈高壓大鼠的炎癥，其機(jī)制可能是通過(guò)NF-κB／NLRP3 信號(hào)通路發(fā)揮作用。