鄭文蘭，范 敏，文曉敏

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，貴州 貴陽(yáng) 550001； 2.貴陽(yáng)市花溪區(qū)中醫(yī)院婦科，貴州 貴陽(yáng) 550025）

異位妊娠是婦科常見(jiàn)病，其中輸卵管妊娠占95% 以上［1］。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為異位妊娠的主要病機(jī)是少腹血瘀實(shí)證，治療以活血化瘀消癥殺胚為法。研究顯示化瘀消癥殺胚中藥能夠誘導(dǎo)人輸卵管妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡［2］。本課題組前期研究顯示，加味宮外孕Ⅱ號(hào)方可能通過(guò)降低早孕大鼠滋養(yǎng)細(xì)胞Bcl-2／Bax 比值及改變滋養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)達(dá)到殺胚目的［3-4］，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，但中醫(yī)藥介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚不清楚。calpain-1 與caspase-12 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）誘導(dǎo)凋亡途徑中的重要分子，有研究指出ERS 可通過(guò)激活caspase-12 信號(hào)通路誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡［5］，由此推測(cè)加味宮外孕Ⅱ號(hào)方可能導(dǎo)致過(guò)度ERS，激活caspase-12 信號(hào)通路促使滋養(yǎng)葉細(xì)胞凋亡。報(bào)道顯示輸卵管妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)能力和侵襲能力方面與宮內(nèi)早孕滋養(yǎng)細(xì)胞無(wú)明顯差異，提出宮內(nèi)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞可代替輸卵管妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究［6］。本實(shí)驗(yàn)以人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8／SVneo 代替異位妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞來(lái)探討加味宮外孕Ⅱ號(hào)方治療異位妊娠的機(jī)理，為中醫(yī)藥保守治療異位妊娠提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 HTR-8／SVneo 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系由武漢華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院提供。SPF 級(jí)雌性SD 大鼠36 只，體質(zhì)量180～220 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（鄂）2015-0018，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)20182901）。

1.2 藥物 加味宮外孕Ⅱ號(hào)方由丹參15 g、赤芍15 g、桃仁9 g、三棱9 g、莪術(shù)9 g、蜈蚣4 g、全蝎6 g、土鱉蟲(chóng)10 g、紫草25 g 組成；注射用甲氨蝶呤，廣東嶺南制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)872016，規(guī)格0.1 g／支，上述藥物均購(gòu)于貴州省中醫(yī)院。

1.3 試劑與儀器 RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)11875-093、10091-148）；CCK-8 細(xì)胞增殖試劑盒（合肥白鯊生物科技有限公司，批號(hào)BS350B）；BCA 蛋白定量試劑盒、Fluo-3 AM Ca2＋熒光探針（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)P0010、S1056）；兔抗calpain-1 多克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)BA0679、BA1054）；兔抗caspase-12 多克隆抗體（英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)ab62484）；細(xì)胞凋亡試劑盒AnnexinV-APC／7-AAD（天津三箭生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)AO2001-11A-H）；逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號(hào)R101-01／02、Q111-02）；引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。Multiskan MK3 型酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Thermo 公司；QuantStudio 6 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)于美國(guó)ABI 公司；CytoFLEX 型流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)Beckman 公司。

2 方法

2.1 加味宮外孕Ⅱ號(hào)方藥液制備 上述中藥材經(jīng)混合浸泡、水煎、過(guò)濾、濃縮，制成生藥量3 g／mL 的藥液，保存于4 ℃冰箱備用。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 36 只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，即陰性對(duì)照組，中藥（加味宮外孕Ⅱ號(hào)方）低、中、高劑量組，西藥（甲氨蝶呤）組及中西藥結(jié)合組（中劑量加味宮外孕Ⅱ號(hào)方＋甲氨蝶呤）。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開(kāi)始給藥，參考人與大鼠等效劑量換算公式［7］，中藥低、中、高劑量組分別灌胃給予12、24、48 g／kg 加味宮外孕Ⅱ號(hào)方；陰性對(duì)照組灌胃給予等量生理鹽水；西藥組與中西藥結(jié)合組分別灌胃給予生理鹽水和24 g／kg 加味宮外孕Ⅱ號(hào)方，每天灌胃1 次，連續(xù)8 d，在第8 天灌胃后均一次性肌肉注射7.775 mg／kg 甲氨蝶呤。

2.3 含藥血清制備 每組大鼠分別于第8 天末次給藥1 h后，水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟采血，靜置2 h，3 000 r／min 離心12 min，吸取血清，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌，56 ℃水浴滅活30 min，將同組所有大鼠的血清混合，分裝后置于－80 ℃冰箱備用。

2.4 HTR-8／SVneo 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥 用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到培養(yǎng)皿中，輕揉吹打混勻，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，按1∶3 比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以5×105／mL 密度接種于6 孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，棄培養(yǎng)液，更換RPMI 1640 培養(yǎng)基，加入對(duì)應(yīng)組別的10%含藥血清，同時(shí)設(shè)置僅添加細(xì)胞培養(yǎng)基的HTR-8／SVneo 細(xì)胞作為空白對(duì)照組，以排除灌胃生理鹽水組大鼠血清對(duì)細(xì)胞的異常影響。

2.5 CCK-8 法檢測(cè)HTR-8／SVneo 細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HTR-8／SVneo 細(xì)胞，按每孔8×103個(gè)的密度接種于96孔板中，每孔200 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，分別加入5%、10%、15% 含藥血清繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后每孔加入20 μL CCK-8，輕搖混勻，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔于450 nm 波長(zhǎng)處吸光度（A）值，以此確定藥物作用于細(xì)胞的最佳體積分?jǐn)?shù)。細(xì)胞增殖抑制率＝（A對(duì)照－A實(shí)驗(yàn)）／（A對(duì)照－A空白）×100%。

2.6 指標(biāo)檢測(cè) 各組細(xì)胞分別與對(duì)應(yīng)的含藥血清共培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，用于以下指標(biāo)檢測(cè)。

2.6.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 按照AnnexinV-APC／7-AAD 細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，加入2 μL AnnexinVAPC 混勻后再加入2 μL 7-AAD，室溫避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。細(xì)胞凋亡率＝早期凋亡細(xì)胞比例＋晚期凋亡細(xì)胞比例。

2.6.2 Ca2＋熒光探針檢測(cè)胞漿Ca2＋水平 按Fluo-3 AM 試劑說(shuō)明書(shū)，加入Fluo-3 AM（終濃度5 μmol／L），置于37 ℃培養(yǎng)箱，避光孵育30 min，PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞2 次，1 500 r／min離心3 min，加500 μL PBS 重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm，以熒光指數(shù)反映胞漿Ca2＋水平。

2.6.3 Western blot 法檢測(cè)calpain-1、caspase-12 蛋白表達(dá) 提取總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性10 min，冷卻至室溫，于－20 ℃保存。SDS-聚丙烯酰胺凝膠上樣后電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，一抗calpain-1（1∶500）、caspase-12（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜5 次，HRP 標(biāo)記二抗（1∶5 000）37 ℃孵育2 h，TBST 洗膜5次，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑曝光，X 膠片顯影定影，BandScan軟件分析膠片灰度值。

2.6.4 RT-qPCR 法檢測(cè)calpain-1、caspase-12 mRNA 表達(dá) 加入TRIzol 冰上裂解10 min 提取總RNA，微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的純度和濃度，置于－80 ℃保存，用于逆轉(zhuǎn)錄。RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為25 ℃ 5 min，50 ℃15 min，85 ℃5 min，4 ℃10 min；配制20 μL 體系進(jìn)行基因擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為50 ℃2 min，95 ℃10 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。以2－ΔΔCT法進(jìn)行分析。GAPDH正向序列5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′，反向序列5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′；caspase-12 正向序 列 5′-CATCCAACGGTGTTCTGGTC-3′，反向序列 5′-TTGCCTGCAATTTGAGCTGT-3′；calpain-1 正向序列 5′-GGGTCCCAATTCCTCCAAGA-3′，反向序列5′-CTGGAAATGG AAGATGCCGG-3′。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 加味宮外孕Ⅱ號(hào)方對(duì)HTR-8／SVneo 細(xì)胞增殖能力的影響 與陰性對(duì)照組比較，各含藥血清組細(xì)胞增殖抑制率增加（P＜0.05），且呈劑量依賴性，對(duì)HTR-8／SVneo 細(xì)胞具有增殖抑制作用。10% 含藥血清作用細(xì)胞24 h，中藥高劑量組細(xì)胞抑制率大于50%，為避免含藥血清濃度過(guò)大引起細(xì)胞毒性，本實(shí)驗(yàn)確定10%含藥血清作用于細(xì)胞24 h 為最佳，見(jiàn)表1。

表1 各組HTR-8／SVneo 細(xì)胞增殖抑制率比較（±s， n ＝3）

表1 各組HTR-8／SVneo 細(xì)胞增殖抑制率比較（±s， n ＝3）

注：與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05。

3.2 加味宮外孕Ⅱ號(hào)方對(duì)HTR-8／SVneo 細(xì)胞凋亡率的影響 空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較無(wú)差異（P＞0.05）；各給藥組細(xì)胞凋亡率均高于陰性對(duì)照組（P＜0.05），其中中藥各劑量組作用呈劑量依賴性（P＜0.05）；中藥高劑量組細(xì)胞凋亡率高于西藥組（P＜0.05），與中西藥結(jié)合組比較無(wú)差異（P＞0.05）；西藥組與中西藥結(jié)合組比較無(wú)差異（P＞0.05），見(jiàn)表2、圖1。

圖1 各組HTR-8／SVneo 細(xì)胞凋亡率比較

表2 各組HTR-8／SVneo 細(xì)胞凋亡率及胞漿內(nèi)Ca2＋水平比較（±s， n＝3）

表2 各組HTR-8／SVneo 細(xì)胞凋亡率及胞漿內(nèi)Ca2＋水平比較（±s， n＝3）

與陰性對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與中藥低劑量組比較，▲P ＜0.05；與中藥中劑量組比較，□P ＜0.05；與中藥高劑量組比較，△P＜0.05。

3.3 加味宮外孕Ⅱ號(hào)方對(duì)HTR-8／SVneo 細(xì)胞胞漿內(nèi)Ca2＋水平的影響 空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較無(wú)差異（P＞0.05）；與陰性對(duì)照組比較，中藥低劑量組細(xì)胞胞漿內(nèi)Ca2＋水平無(wú)明顯上升（P＞0.05），但中、高劑量組、西藥組及中西藥結(jié)合組細(xì)胞胞漿內(nèi)Ca2＋水平升高（P＜0.05）；中藥高劑量組細(xì)胞胞漿內(nèi)Ca2＋水平高于西藥組及中西藥結(jié)合組（P＜0.05）；西藥組與中西藥結(jié)合組比較無(wú)差異（P＞0.05），見(jiàn)表2、圖2。

圖2 各組HTR-8／SVneo 細(xì)胞胞漿內(nèi)Ca2＋水平流式圖

3.4 加味宮外孕Ⅱ號(hào)方對(duì)HTR-8／SVneo 細(xì)胞calpain-1、caspase-12 蛋白表達(dá)的影響 空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較無(wú)差異（P＞0.05）；與陰性對(duì)照組比較，各給藥組細(xì)胞calpain-1 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）；中藥高劑量組細(xì)胞calpain-1 蛋白表達(dá)高于低、中劑量組、西藥組及中西藥結(jié)合組（P＜0.05）；中西藥結(jié)合組細(xì)胞calpain-1 蛋白表達(dá)高于西藥組（P＜0.05）。與陰性對(duì)照組比較，中藥低、中劑量組caspase-12 蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05），高劑量組、西藥組及中西藥結(jié)合組caspase-12 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與西藥組和中藥高劑量組比較，中西藥結(jié)合組caspase-12 蛋白表達(dá)量升高更明顯（P＜0.05），見(jiàn)表3、圖3。

圖3 各組HTR-8／SVneo 細(xì)胞calpain-1、caspase-12 蛋白條帶圖

表3 各組HTR-8／SVneo 細(xì)胞calpain-1、caspase-12 蛋白表達(dá)比較（±s， n＝3）

表3 各組HTR-8／SVneo 細(xì)胞calpain-1、caspase-12 蛋白表達(dá)比較（±s， n＝3）

注：與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05；與中藥高劑量組比較，△P＜0.05；與西藥組比較，●P＜0.05。

3.5 加味宮外孕Ⅱ號(hào)方對(duì)HTR-8／SVneo 細(xì)胞calpain-1、caspase-12 mRNA 表達(dá)的影響 空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較無(wú)差異（P＞0.05）；與陰性對(duì)照組比較，各給藥組calpain-1 mRNA 表達(dá)均升高（P＜0.05）；中藥高劑量組calpain-1 mRNA 表達(dá)高于低、中劑量組及西藥組（P＜0.05）；中西藥結(jié)合組與中藥高劑量組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與陰性對(duì)照組比較，中藥高劑量組、西藥組及中西藥結(jié)合組caspase-12 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.05）；而中藥低、中劑量組無(wú)明顯變化（P＞0.05）；中西藥結(jié)合組與中藥高劑量組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 各 組 HTR-8／SVneo 細(xì) 胞 calpain-1、 caspase-12 mRNA 表達(dá)比較（±s， n＝3）

表4 各 組 HTR-8／SVneo 細(xì) 胞 calpain-1、 caspase-12 mRNA 表達(dá)比較（±s， n＝3）

注：與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05；與中藥低劑量組比較，▲P＜0.05；與中藥中劑量組比較，□P ＜0.05；與中藥高劑量組比較，△P＜0.05。

4 討論

加味宮外孕Ⅱ號(hào)方中丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術(shù)有活血化瘀消癥之功效；蜈蚣、全蝎、土鱉蟲(chóng)、紫草有破血、通絡(luò)、損害胚胎的作用?，F(xiàn)代藥理研究認(rèn)為丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術(shù)能促進(jìn)盆腹腔胚胎組織及包塊的吸收；配伍蜈蚣、全蝎、土鱉蟲(chóng)、紫草可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，致其變性壞死，降低胚胎活性，增強(qiáng)殺胚作用，且能改善輸卵管通暢度［8-9］。為驗(yàn)證加味宮外孕Ⅱ號(hào)方對(duì)細(xì)胞凋亡影響的劑量依賴性，本研究比較了不同劑量中藥組對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，中藥各劑量組、西藥組和中西藥結(jié)合組細(xì)胞凋亡率升高，說(shuō)明加味宮外孕Ⅱ號(hào)方及甲氨蝶呤均可以誘導(dǎo)HTR-8／SVneo 細(xì)胞凋亡，間接提示該方可以降低滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)輸卵管管壁的增殖和侵襲能力，減少病灶破裂風(fēng)險(xiǎn)，保留輸卵管的完整性。中藥高劑量組、西藥組及中西藥結(jié)合組Ca2＋水平較陰性對(duì)照組上升了約2 倍，提示經(jīng)中藥與西藥處理后細(xì)胞內(nèi)Ca2＋水平增加，鈣超載。Ca2＋作為細(xì)胞內(nèi)第二信使，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)集聚過(guò)多未折疊及錯(cuò)誤折疊蛋白，可引起大量Ca2＋外流，胞質(zhì)Ca2＋水平升高，鈣超載，calpain 被激活，發(fā)揮蛋白水解功能，產(chǎn)生細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)［10］。研究顯示中藥各劑量組作用呈劑量依賴性，細(xì)胞凋亡率與胞漿內(nèi)Ca2＋水平有升高趨勢(shì)。

calpain 屬于鈣依賴性半胱氨酸蛋白水解酶家族成員，根據(jù)激活時(shí)所需Ca2＋水平差異，分為calpain-1（μ-calpain）和calpain-2（m-calpain），對(duì)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架重塑及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有重要作用［11］，正常狀態(tài)下以無(wú)活性的酶原形式存在于組織和細(xì)胞中，由Ca2＋紊亂激活，多項(xiàng)研究提示calpain-1 與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［12-13］，calpain-1 在滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡中起作用［14］。caspase-12 是caspase 家族中唯一僅在ERS 反應(yīng)時(shí)激活的蛋白，在死亡受體途徑及線粒體途徑中不發(fā)生活化［15］，是ERS 反應(yīng)性凋亡的關(guān)鍵分子。caspase-12 被激活的機(jī)制之一是Ca2＋依賴的calpain 水解活化，calpain 從胞質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，剪切激活caspase-12 前體，進(jìn)一步活化caspase-12，最終通過(guò)激活下游靶分子caspase-3 促進(jìn)細(xì)胞凋亡［16-17］。進(jìn)一步研究顯示，經(jīng)中藥與西藥含藥血清處理24 h 后，calpain-1、caspase-12 蛋白及mRNA 相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)，說(shuō)明其參與了調(diào)控ERS 反應(yīng)，被過(guò)度激活，說(shuō)明加味宮外孕Ⅱ號(hào)方含藥血清作用于人滋養(yǎng)細(xì)胞后使細(xì)胞發(fā)生過(guò)度ERS 反應(yīng)，從而加速細(xì)胞凋亡。中藥和甲氨蝶呤發(fā)揮促滋養(yǎng)葉細(xì)胞凋亡作用可能是依賴caspase-12 途徑；再結(jié)合HTR-8／SVneo 細(xì)胞的凋亡率及Ca2＋水平變化，提示加味宮外孕Ⅱ號(hào)方和甲氨蝶呤可能通過(guò)上調(diào)胞漿內(nèi)Ca2＋水平，調(diào)控細(xì)胞caspase-12 通路中關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)促滋養(yǎng)葉細(xì)胞凋亡而終止妊娠。從研究結(jié)果看，中藥高劑量組與西藥組及中西藥結(jié)合組效果相近，而甲氨蝶呤副作用大，臨床上用于異位妊娠保守治療的不良反應(yīng)時(shí)有報(bào)道，除肝腎、皮膚毒性外，對(duì)生殖系統(tǒng)可產(chǎn)生致畸、致突變作用［18-19］，因此，對(duì)于今后異位妊娠保守治療用藥選擇上是否可以首選中藥，并根據(jù)患者情況適當(dāng)增加中藥劑量，制定個(gè)體化最佳用藥方案具有參考價(jià)值。

綜上所述，加味宮外孕Ⅱ號(hào)方能夠誘導(dǎo)滋養(yǎng)葉細(xì)胞凋亡，且高劑量作用最佳，其機(jī)制可能是通過(guò)激活caspase-12信號(hào)通路，使細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生過(guò)度應(yīng)激反應(yīng)，上調(diào)促凋亡因子的表達(dá)而加速滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡。