岳曉華張小平孫少伯王碧瑩謝曉蓉耿廣琴安方玉

（1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學敦煌醫(yī)學與轉(zhuǎn)化教育部重點實驗室，甘肅蘭州 730000）

伊立替康廣泛用于治療結(jié)腸癌、胃癌、肺癌等，通過抑制DNA 拓撲異構(gòu)酶I 發(fā)揮其抗腫瘤作用［1］，其常見副作用為腹痛、腹瀉、消瘦等，屬于中醫(yī)“泄瀉” 范疇［2］。伊立替康是腹瀉發(fā)生的重要外因，屬于中醫(yī)“毒邪”，使脾胃受損，運化失調(diào)，進而水濕內(nèi)生，導致泄瀉的發(fā)生。目前伊立替康所導致的腹瀉的中醫(yī)證型認為有脾胃虛弱證、脾腎陽虛證、寒熱錯雜證、濕熱內(nèi)蘊證、肝郁脾虛證等［3］，其中脾胃虛弱是其基本病機。敦煌古方大補脾湯主治脾氣大疲、飲食不化。因此，本研究探討大補脾湯對伊立替康導致的脾胃虛弱型腹瀉的影響。

1 材料

1.1 動物 50 只BALB／c 小鼠，6 周齡，體質(zhì)量18～20 g，購于甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（甘）2015-0002。

1.2 試劑與藥物 大補脾湯（人參、炙甘草、干姜各15 g，白術(shù)、麥冬、五味子、旋覆花各5 g），購自北京同仁堂股份有限公司，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學高建德副教授鑒定合格。伊立替康（澳大利亞Pfizer Pty Limited 公司，批號H20160576）；TRIzol（美 國Ambion 公 司，批號15596-026）；逆轉(zhuǎn)錄酶、熒光定量PCR 參比染料（南京唯諾贊生物科技股份有限公司，批號R101-01／02、Q111-02）；核糖核酸酶抑制劑（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號J11202）；兔多抗GAPDH（杭州賢至生物有限公司，批號AB-P-R 001）；兔多抗MRP2（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號bs-1092R）。

2 方法

2.1 藥物制備 藥材浸泡30 min，大火煮沸后用小火煎煮30 min，過濾，藥渣加水，同法再次煎煮30 min，過濾藥渣，合并藥液，濃縮至生藥量0.9 g／mL，－20 ℃下貯存。

2.2 分組及給藥 將50 只小鼠隨機分為空白組、模型組及大補脾湯低、中、高劑量組。除空白組外，其余各組小鼠腹腔注射伊立替康（36.8 mg／kg），每天1 次，連續(xù)4 d［4］。造模成功后，給予大補脾湯低、中、高劑量組4.29、8.58、17.16 g／kg 藥液，每天1 次，連續(xù)7 d。

2.3 取材 期間觀察各組小鼠的飲食、進水、精神和腹瀉等情況并記錄，同時計算小鼠稀便率、平均稀便級以及腹瀉指數(shù)。稀便級即稀便程度，用濾紙量稀便污染面積定級，每污染直徑＜1.0 cm 為1 級；污染直徑1.0～1.9 cm 為2級；污染直徑2.0～3.0 cm 為3 級；污染直徑＞3.0 cm 為4級。平均稀便級＝每只小鼠所有稀便級數(shù)相加的和／稀便次數(shù)。稀便率＝每只小鼠稀便數(shù)／總便數(shù)。以腹瀉指數(shù)作為評定小鼠腹瀉情況的主要指標［5-6］，腹瀉指數(shù)＝稀便率×平均稀便級。干預7 d 后摘眼球取血，注射器抽取結(jié)腸內(nèi)容物測定β-葡萄糖醛酸苷酶活性，同時取小腸、肝臟組織樣本，收集混合糞便。

2.4 組織形態(tài)學觀察 取小腸組織，4% 多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，組織透明，石蠟浸蠟，包埋，切片（厚度4 μm），脫蠟，蘇木精-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.5 小鼠糞便總DNA 的提取和PCR 擴增檢測 取小鼠混合軟濕糞便，總基因組DNA 用CTAB-SDS 法提取，稀釋DNA 為1 ng／μL，用帶有barcode 的特異引物擴增16S rRNA／18S rRNA／ITS 基因的V3＋V4 可變區(qū)（16S V4／16S V3／16S V3～V4／16S V4～V5，18S V4／18S V9，ITS1／ITS2，Arc V4 等）并測序。擴增體系為10 ng 模板DNA，正反向引物0.2 μmol／L，15 μL Phusion 超保真PCR Master Mix，總體積30 μL。PCR 擴增條件98 ℃預變性1 min，98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃溫度下5 min，共30 個循環(huán)。

2.6 RT-qPCR 檢測大腸桿菌相對數(shù)量 參照試劑盒說明書，提取基因組DNA，依據(jù)大腸桿菌的16S rRNA 序列設計引物（表1），將基因組DNA 稀釋到60 ng／μL，RTqPCR 法檢測小鼠大腸桿菌的相對數(shù)量，反應條件為50 ℃2 min，95 ℃10 min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)。通過2－ΔΔCT方法計算大腸桿菌的相對數(shù)量。

表1 引物序列

2.7 腸道β-葡萄糖醛酸苷酶的測定 取結(jié)腸內(nèi)容物，稱定質(zhì)量，加入9 倍量PBS，混勻，3 000 r／min 離心10 min，取上清，用比色法測定腸道β-葡萄糖醛酸苷酶活性。

2.8 Western blot 法檢測多藥耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2）的表達 收集各組肝臟組織，加入裂解液處理30 min，離心，提取總蛋白，BAC 法測定蛋白濃度，95 ℃水浴變性，10%分離膠、5% 濃縮膠SDS-PAGE 蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉-TBST 室溫封閉2 h，加入一抗（MRP2、GAPDH，1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜5 次，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST 洗膜5 次，ECL 試劑盒顯示免疫反應條帶，Bandscan 軟件分析膠片灰度值，GAPDH 作為內(nèi)參，以目的條帶／GAPDH 條帶灰度值的比值表示目的條帶的相對表達量。

2.9 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 18.0 軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 空白組小鼠飲食正常，反應敏捷，大便成形、質(zhì)硬，無其他明顯異常改變；模型組小鼠出現(xiàn)蜷縮、倦臥、飲食減少、糞便稀溏、肛周黏膩等現(xiàn)象，體質(zhì)量有所下降；大補脾湯干預后，上述癥狀均有所改善，主要表現(xiàn)為活動增加，體質(zhì)量回升，腹瀉程度減輕。

3.2 腹瀉情況 與空白組比較，模型組小鼠稀便率、平均稀便級、腹瀉指數(shù)均升高（P＜0.01）；與模型組比較，大補脾湯各劑量組小鼠稀便率、平均稀便級和腹瀉指數(shù)均降低（P＜0.01），說明大補脾湯可有效減輕伊立替康所造成的腹瀉，見表2。

表2 各組腹瀉指數(shù)比較（±s， n＝10）

表2 各組腹瀉指數(shù)比較（±s， n＝10）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.3 小腸黏膜組織病理觀察 如圖1 所示，空白組小鼠小腸黏膜上皮完整，絨毛結(jié)構(gòu)排列規(guī)則整齊，隱窩結(jié)構(gòu)清晰；模型組小腸絨毛的形態(tài)和完整性被破壞，絨毛數(shù)量明顯減少，并可見大量絨毛變形、脫落、斷裂（黑色箭頭所示），以及伴隨隱窩結(jié)構(gòu)的消失；而大補脾湯中、高劑量組小腸絨毛結(jié)構(gòu)較完整，并可見明顯的隱窩結(jié)構(gòu)。

圖1 小鼠小腸病理形態(tài)（×100）

3.4 腸道菌群豐度 伊立替康治療很容易導致腸道菌群的紊亂［7］，治療后腸道菌群的組成及豐度都有所變化［8］。如圖2 所示，伊立替康引起乳桿菌等益生菌的數(shù)量減少，假單胞菌、擬桿菌、丹毒絲菌等有害菌的升高；大補脾湯干預后，乳桿菌數(shù)量明顯回升，有害菌的增殖被抑制。

圖2 微生物種類分布情況

3.5 大腸桿菌數(shù)量變化 伊立替康毒性導致大腸桿菌的數(shù)量增加是引起腹瀉的原因之一［9］。與空白組比較，模型組大腸桿菌數(shù)量增加（P＜0.01）；與模型組比較，大補脾湯中、高劑量組大腸桿菌數(shù)量減少（P＜0.01），證明大補脾湯干預對伊立替康所導致的大腸桿菌升高有抑制作用，見表3。

表3 各組大腸桿菌數(shù)量比較（±s， n＝10）

表3 各組大腸桿菌數(shù)量比較（±s， n＝10）

注：與空白組比較，＃＃P ＜0.01；與模型組比較，* P ＜0.05，**P＜0.01。

3.6 β-葡萄糖醛酸苷酶活性變化 腸道共生菌群表達的細菌β-葡萄糖醛酸苷酶在藥物誘導的胃腸道上皮細胞毒性中起著重要作用［9-10］。如表4 所示，模型組β-葡萄糖醛酸苷酶活性升高（P＜0.01）；與模型組比較，大補脾湯各劑量組β-葡萄糖醛酸苷酶活性均有不同程度的降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 各組小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶活性比較（±s， n＝10）

表4 各組小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶活性比較（±s， n＝10）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.7 MRP2 蛋白表達 MRP2 介導伊立替康及其代謝產(chǎn)物的排泄［11］，如圖3、表5 所示，伊立替康導致肝臟MRP2表達升高（P＜0.05）；經(jīng)大補脾湯干預后，MRP2 表達下降（P＜0.01）。

圖3 MRP2 蛋白條帶圖

表5 各組MRP2 蛋白表達比較（±s， n＝10）

表5 各組MRP2 蛋白表達比較（±s， n＝10）

注：與空白組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.01。

4 討論

伊立替康常見的臨床副作用是遲發(fā)性腹瀉，多表現(xiàn)為排便次數(shù)增加、糞便稀溏、甚至瀉出如水樣，或伴有嘔吐、腹痛脹氣、乏力等癥狀，屬于“泄瀉” “下利” 范疇。癌癥屬于消耗性疾病，由于病癥日久，患者本就素體虧虛，而化療藥物伊立替康作為一種毒性藥物，使患者脾胃更加虛弱，致使其運化功能失調(diào)，濕濁內(nèi)生，發(fā)生泄瀉［2］，大補脾湯出自《輔行訣五臟用藥法要》，主治脾氣大疲，故本實驗探究大補脾湯對伊立替康致脾胃虛弱型腹瀉的干預作用。

目前普遍認為伊立替康所引起的胃腸道毒性與其獨特的肝腸循環(huán)有關(guān)［12］，伊立替康經(jīng)肝臟代謝產(chǎn)物有7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN-38）、葡萄糖醛酸化SN-38（SN-38G）和部分沒轉(zhuǎn)化的伊立替康，這些代謝產(chǎn)物通過膽汁排泄到腸道，SN-38G 在腸道菌群分泌的β-葡萄糖醛酸苷酶的作用下生成有毒性的SN-38。SN-38 可直接損傷腸黏膜，導致體內(nèi)水分、電解質(zhì)吸收障礙以及腸道炎癥的發(fā)生，引起嚴重腹瀉［10］。本實驗結(jié)果顯示，大補脾湯可以有效降低小鼠腹瀉指數(shù)和炎癥因子水平，明顯改善腸道黏膜損傷。前人認為健脾中藥通過抑制伊立替康引發(fā)的炎性反應而減輕對腸黏膜的損傷［13］，與本研究一致。

研究發(fā)現(xiàn)，伊立替康治療后會導致患者腸道菌群失調(diào)［9，12］，當腸道菌群紊亂時，會出現(xiàn)乏力、納呆、腹脹、腹瀉等癥狀，即出現(xiàn)中醫(yī)脾胃虛弱的癥狀［14］。因此，通過健脾類中藥來調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡對減輕伊立替康所導致的脾胃虛弱具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，大補脾湯干預后腸道菌群的失調(diào)得以改善，假單胞菌、擬桿菌、丹毒絲菌等有害菌數(shù)量下降，乳桿菌等益生菌數(shù)量上升。

另外，研究發(fā)現(xiàn)，伊立替康治療后會導致致病菌特別是大腸桿菌大量增加，而β-葡萄糖醛酸苷酶的增多與大腸桿菌的增多有關(guān)［9］，細菌β-葡萄糖醛酸苷酶在伊立替康誘導的胃腸道上皮細胞毒性中發(fā)揮重要作用［10］。本研究結(jié)果表明，大補脾湯組大腸桿菌數(shù)量和β-葡萄糖醛酸苷酶活性均有所下降，可能是大補脾湯有效抑制了大腸桿菌的過度繁殖，降低了細菌β-葡萄糖醛酸苷酶活性而減輕了伊立替康的毒性。

MRP2 是伊立替康及其代謝產(chǎn)物在細胞外的轉(zhuǎn)運體，介導了SN-38G 從膽汁排泄至腸腔中的過程。SN-38G 在小腸中β-葡萄糖醛酸苷酶的作用下轉(zhuǎn)化為有毒性的SN-38，進而被重吸收、蓄積而引發(fā)腸黏膜細胞的損傷和腹瀉［11］，本研究結(jié)果顯示，大補脾湯干預后MRP2 蛋白表達下降，腹瀉程度得到改善，可能是大補脾湯通過抑制了MRP2 蛋白表達減少伊立替康及其代謝產(chǎn)物從膽汁向小腸的排泄，進而減少SN-38 在小腸的暴露而改善伊立替康所導致的腹瀉，Guan 等［15］研究同樣發(fā)現(xiàn)生姜瀉心湯也能下調(diào)MRP2 表達，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，大補脾湯能緩解伊立替康所導致的小鼠腹瀉，其可能是通過改善腸道菌群失衡，抑制大腸桿菌繁殖，進而降低細菌β-葡萄糖醛酸苷酶的產(chǎn)生和MRP2 的表達，從而減少SN-38G 轉(zhuǎn)化為毒性物質(zhì)SN-38 在小腸的暴露。