韓江云，王春龍，李建平劉明華，陳斯瑋，張 丹*

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，四川 瀘州 646000； 2.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000）

清咽潤喉復(fù)方由青龍白虎湯加荷葉而來。青龍白虎湯，出自清代著名醫(yī)家《王氏醫(yī)案》 卷二［1］，由鮮青果、鮮萊菔組成，具有清熱瀉火、解毒利咽、生津止渴的功效，可用于治療慢性咽炎［2］。青果，《本草綱目》 中記載“生津液，止煩渴，治咽喉痛”；現(xiàn)代研究表明，青果中黃酮和沒食子酸均有抗炎、鎮(zhèn)痛作用［3］。萊菔，即蘿卜，為藥食同源中藥，可清熱解毒、理氣寬中；現(xiàn)代研究表明，蘿卜具有清熱生津、化痰止咳等作用［4］。荷葉，可除暈清痰、泄氣、止嘔；現(xiàn)代研究表明，荷葉中生物堿、黃酮類化合物具有抗菌、消炎等功效［5］。

復(fù)方現(xiàn)代研究中，醇和水為最常用提取溶劑，不同溶劑性質(zhì)各異，故同一復(fù)方經(jīng)不同溶劑提取，在成分種類、含量等方面也存在明顯差異，將極大地影響復(fù)方藥效發(fā)揮。因此，將有效成分和藥效學(xué)相結(jié)合考察不同提取方法對(duì)復(fù)方藥效的影響是一個(gè)更全面、更科學(xué)的考察方法［6］。本研究以清咽潤喉復(fù)方為研究對(duì)象，通過對(duì)比其有效成分含量和抗炎鎮(zhèn)痛效果探究最佳提取方法，以期為開發(fā)安全可靠、服用方便的清咽潤喉相關(guān)產(chǎn)品奠定理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)支撐。

1 材料

1.1 試劑與藥物 青果、荷葉購自四川天植中藥股份有限公司，經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室莊元春副教授鑒定為正品，均符合2020 年版《中國藥典》 一部各飲片項(xiàng)下要求；蘿卜、雞蛋清購自瀘州市菜市場。沒食子酸（批號(hào)MUST-17022801，純度 99%）、荷葉堿（批號(hào) MUST-17030204，純度98.91%）對(duì)照品購自成都曼思特生物科技有限公司；濱蒿內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)Z05D7B26157，純度98%）購自上海源葉生物科技有限公司；二甲苯（批號(hào)20150628）購自成都欣正通化工有限公司；地塞米松（批號(hào)110310）購自北京百靈威科技有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純，購自成都科隆化學(xué)品有限公司；冰乙酸為分析純，購自天津申泰化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器 LC-2030C 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SQP 型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；艾柯超純水機(jī)（成都唐氏唐寧科技發(fā)展有限公司）。

1.3 動(dòng)物 SPF 級(jí)昆明種小鼠、SPF 級(jí)SD 大鼠均由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川）2018-0017，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK（川）2018-0063。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與測定

2.1.1 提取方法

2.1.1.1 醇提法 將30 g 清咽潤喉復(fù)方用10 倍量70%乙醇加熱回流3 次，合并濾液，濃縮至適當(dāng)體積，即得清咽潤喉復(fù)方醇提液。

2.1.1.2 水提法 將30 g 清咽潤喉復(fù)方用10 倍量水加熱提取3 次，濃縮濾液至適當(dāng)體積，即得清咽潤喉復(fù)方水提液。

2.1.1.3 醇水雙提法 先將適量青果、荷葉用10 倍量70%乙醇加熱回流3 次，過濾，回收乙醇；另將濾渣與萊菔用10 倍量純水加熱提取3 次，過濾，合并乙醇提取物和水提取物，濃縮至當(dāng)體積，即得清咽潤喉復(fù)方醇水雙提液。

2.1.1.4 揮發(fā)油雙提法 稱取青果、荷葉適量，打成粗粉，置圓底燒瓶中，加10 倍量水，浸泡30 min，按照2020年版《中國藥典》 四部通則2204 揮發(fā)油測定法（甲法）提取，收集揮發(fā)油，濾渣用10 倍量70%乙醇提取3 次，過濾，回收乙醇；濾渣與萊菔加入10 倍量水，加熱提取3次，過濾，合并乙醇提取物和水提取物，濃縮至適當(dāng)體積，加入揮發(fā)油，即得清咽潤喉復(fù)方揮發(fā)油雙提液。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 供試品溶液 分別量取10 mL “2.1.1” 項(xiàng)下4種提取液，揮干，10 mL 甲醇溶解，置于10 mL 棕色量瓶中，加甲醇定容，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱取沒食子酸、濱蒿內(nèi)酯對(duì)照品適量，置于25 mL 棕色量瓶中，加入甲醇溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，制成質(zhì)量濃度為0.060 9、0.008 2 mg／mL 的混合對(duì)照品溶液。精密稱取荷葉堿對(duì)照品適量，置于25 mL 棕色量瓶內(nèi)，加甲醇溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，制成質(zhì)量濃度為0.010 4 mg／mL的對(duì)照品溶液。

2.1.3 色譜條件

2.1.3.1 沒食子酸、濱蒿內(nèi)酯 參考文獻(xiàn) ［7］報(bào)道，SHIMADZU Shim-pack GIST C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.5% 冰乙酸（B），梯度洗脫（0～5 min，2.5% A；5～21 min，2.5%～27% A；21～30 min，27%～35% A；30～32 min，35%～2.5% A；32～37 min，2.5%A）；體積流量1.0 mL／min；檢測波長271 nm（沒食子酸）、345 nm（濱蒿內(nèi)酯）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)以沒食子酸計(jì)不低于3 000；以濱蒿內(nèi)酯計(jì)不低于2 000。

2.1.3.2 荷葉堿 參考文獻(xiàn)［8］報(bào)道，SHIMADZU Shimpack GIST C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.1%三乙胺（60∶40）；體積流量0.8 mL／min；檢測波長270 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)以荷葉堿計(jì)不低于2 000。

2.1.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.2.2” 項(xiàng)下沒食子酸、濱蒿內(nèi)酯混合對(duì)照品溶液以及荷葉堿對(duì)照品溶液，分別在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣2、4、6、8、10、12 μL，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1。

表1 各成分線性關(guān)系

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2.2” 項(xiàng)下沒食子酸、濱蒿內(nèi)酯混合對(duì)照品溶液以及荷葉堿對(duì)照品溶液10 μL，分別在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得沒食子酸、濱蒿內(nèi)酯、荷葉堿峰面積RSD 分別為1.70%、2.00%、0.27%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份“2.1.2.2” 項(xiàng)下沒食子酸、濱蒿內(nèi)酯混合對(duì)照品溶液以及荷葉堿對(duì)照品溶液，于0、2、4、6、12、24 h 在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得沒食子酸、濱蒿內(nèi)酯、荷葉堿峰面積RSD 分別為1.66%、1.00%、1.32%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批“2.1.2.1” 項(xiàng)下供試品溶液6 份，在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得沒食子酸、濱蒿內(nèi)酯、荷葉堿含量RSD 分別為1.00%、2.80%、1.10%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知供試品溶液，加入適量沒食子酸、濱蒿內(nèi)酯、荷葉堿的混合對(duì)照品溶液，按 “2.1.2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，沒食子酸、濱蒿內(nèi)酯、荷葉堿加樣回收率分別為104.21%、103.61%、102.53%，RSD 分別為2.38%、2.84%、2.38%。

2.1.9 干膏率測定 精密吸取“2.1.1” 項(xiàng)下所得提取液各25 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干后，在105 ℃烘箱中干燥3 h，取出置干燥器中，冷卻至室溫后，精密稱定質(zhì)量至恒重，計(jì)算干膏率，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測定結(jié)果

2.1.10 含量測定 精密吸取“2.1.1” 項(xiàng)下所得提取液適量，在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算4 種提取液中沒食子酸、濱蒿內(nèi)酯、荷葉堿含量。以青果中沒食子酸含量、濱蒿內(nèi)酯含量、荷葉中荷葉堿含量、干膏率作為考察指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)設(shè)置為0.3、0.2、0.2、0.3 進(jìn)行綜合評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)中，因沒食子酸、濱蒿內(nèi)酯和荷葉堿均為方中有效成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛效果，其中沒食子酸在方中含量最高，而中藥是多成分的綜合作用，干膏率又為后續(xù)的成型工藝提供一定的依據(jù)，故綜合評(píng)分中二者的權(quán)重系數(shù)分別設(shè)為0.3，濱蒿內(nèi)酯和荷葉堿設(shè)為0.2，公式為綜合評(píng)分＝（A×0.3＋B×0.2＋C×0.2＋D×0.3）×100（A＝?jīng)]食子酸含量／沒食子酸含量最大值，B＝濱蒿內(nèi)酯含量／濱蒿內(nèi)酯含量最大值，C＝荷葉堿含量／荷葉堿含量最大值，D＝干膏率／干膏率最大值）。結(jié)果見表2。

2.2 抗炎鎮(zhèn)痛作用 本研究以小鼠耳廓腫脹、熱板法、扭體法和大鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn)作為藥效學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)4 種提取物抗炎鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行考察［9］。

通過Graphpad prism 5.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［10］報(bào)道，取雄性昆明種小鼠140 只，體質(zhì)量（20±2）g，隨機(jī)分為14 組，每組10 只，分別為醇提法、水提法、醇水雙提法、揮發(fā)油雙提法高、中、低劑量組（18.20、9.10、4.55 g／kg），地塞米松組（10 mg／kg），生理鹽水組，連續(xù)灌胃給藥7 d。末次給藥0.5 h 后，用微量加樣器于其右耳內(nèi)外兩側(cè)均勻涂布二甲苯25 μL／側(cè)，左耳不處理作為對(duì)照。2 h后脫頸椎處死，沿耳廓基部剪下雙耳，用6.0 mm 打耳器在相同位置打下兩圓耳片，各自稱定質(zhì)量，以兩耳片質(zhì)量之差為腫脹程度，并計(jì)算腫脹抑制率。結(jié)果表明，與生理鹽水組比較，地塞米松組，醇提法低、中、高劑量組，水提法高劑量組，醇水雙提法中、高劑量組，揮發(fā)油雙提低、中、高劑量組小鼠耳廓腫脹度降低（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴性，其中以醇提法高劑量組抗炎活性最強(qiáng)，見表3。

表3 清咽潤喉復(fù)方對(duì)小鼠耳廓腫脹程度的影響（±s， n ＝10）

表3 清咽潤喉復(fù)方對(duì)小鼠耳廓腫脹程度的影響（±s， n ＝10）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2.2 角叉菜膠致大鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［10］報(bào)道，取SD 大鼠140 只，雌雄各半，隨機(jī)分為14 組，每組10 只，分別為分別為醇提法、水提法、醇水雙提法、揮發(fā)油雙提法高、中、低劑量組（18.20、9.10、4.55 g／kg），地塞米松組（10 mg／kg），生理鹽水組，連續(xù)灌胃給藥7 d。末次給藥1 h 后，用足趾容積測量儀測其正常右后足跖容積，并于大鼠右后足跖皮下注入新鮮角叉菜膠0.1 mL／爪，分別于致炎后1、2、3、4、5、6 h 測定其右后足跖容積，計(jì)算腫脹值。結(jié)果表明，與生理鹽水組比較，地塞米松組，醇提法低、中、高劑量組，水提法高劑量組，醇水雙提法中、高劑量組，揮發(fā)油雙提低、中、高劑量組大鼠足關(guān)節(jié)腫脹值降低（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴性，其中醇提法、揮發(fā)油雙提法高劑量組抗炎活性最強(qiáng)，見表4。

表4 清咽潤喉復(fù)方對(duì)大鼠足趾腫脹值的影響（±s， n＝10）

表4 清咽潤喉復(fù)方對(duì)大鼠足趾腫脹值的影響（±s， n＝10）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2.3 小鼠熱板法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［11］報(bào)道，取雌性昆明種小鼠140 只，體質(zhì)量（20±2）g，隨機(jī)分為14 組，每組10 只，分別為醇提法、水提法、醇水雙提法、揮發(fā)油雙提法高、中、低劑量組（18.20、9.10、4.55 g／kg），阿司匹林組（200 mg／kg），生理鹽水組，連續(xù)灌胃給藥7 d。于末次給藥后，以熱板法（55±0.5）℃分別在30、60、120 min測量小鼠痛閾值。結(jié)果表明，與生理鹽水組比較，阿司匹林組，醇提法低、中、高劑量組，水提法高劑量組，醇水雙提法中、高劑量組，揮發(fā)油雙提低、中、高劑量組小鼠痛閾值升高（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴性，其中醇提法、揮發(fā)油雙提法高劑量組活性最強(qiáng)，見表5。

表5 清咽潤喉復(fù)方對(duì)小鼠熱板性疼痛的影響（±s， n＝10）

表5 清咽潤喉復(fù)方對(duì)小鼠熱板性疼痛的影響（±s， n＝10）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2.4 小鼠扭體法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［12］報(bào)道，取雄性昆明種小鼠140 只，體質(zhì)量（20±2）g，隨機(jī)分為14 組，每組10 只，分別為醇提法、水提法、醇水雙提法、揮發(fā)油雙提法高、中、低劑量組（18.20、9.10、4.55 g／kg），阿司匹林組（200 mg／kg），生理鹽水組，連續(xù)灌胃給藥7 d。末次藥1 h 后，各組小鼠腹腔注射0.6% 冰醋酸0.1 mL／10 g。以小鼠腹部內(nèi)凹，后肢伸直，臀部抬起，蠕行為指標(biāo)，觀察記錄注射0.6%冰醋酸后15 min 內(nèi)小鼠的扭體次數(shù)，并計(jì)算抑制率。結(jié)果表明，與生理鹽水組比較，阿司匹林組，醇提法低、中、高劑量組，水提法高劑量組，醇水雙提法中、高劑量組，揮發(fā)油雙提低、中、高劑量組小鼠平均扭體次數(shù)減少（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴性，其中醇提法、揮發(fā)油雙提法高劑量活性最強(qiáng)，見表6。

表6 清咽潤喉復(fù)方對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響（±s， n＝10）

表6 清咽潤喉復(fù)方對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響（±s， n＝10）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3 討論

青果多酚具有較好的抗炎活性，青果多酚中沒食子酸含量較多，故可選用沒食子酸為清咽潤喉復(fù)方的指標(biāo)性成分［13］。研究發(fā)現(xiàn)，青果濱蒿內(nèi)酯具有消炎止痛作用，故認(rèn)為沒食子酸、濱蒿內(nèi)酯兩者協(xié)同增效，從而發(fā)揮青果清熱利咽的作用［14］。研究表明，荷葉主要活性成分生物堿抗炎作用最強(qiáng)［15-18］。綜合以上因素考慮，本研究選擇沒食子酸、濱蒿內(nèi)酯、荷葉堿為清咽潤喉復(fù)方有效成分考察指標(biāo)?？赡苡捎跊]食子酸在水中的溶解度大，濱蒿內(nèi)酯、荷葉堿在乙醇中的溶解度大，故本研究中雙提法能將大量水溶性和醇溶性成分提出，增加出膏率，綜合評(píng)分較高（99.39分）。

復(fù)方有效性是多成分綜合作用的結(jié)果，本研究以小鼠耳廓腫脹、熱板法、扭體法、大鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn)作為藥效學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)復(fù)方提取方法進(jìn)行優(yōu)化［9］。結(jié)果表明，醇提法和揮發(fā)油雙提法中、高劑量，醇水雙提法高劑量組均對(duì)小鼠耳廓腫脹度有抑制作用（P＜0.01）；醇提法和揮發(fā)油雙提法中、高劑量組均能減少小鼠平均扭體次數(shù)（P＜0.01）；醇提法和揮發(fā)油雙提法中、高劑量組均能緩解大鼠足關(guān)節(jié)腫脹程度和提高小鼠的痛閾值（P＜0.01），其中醇提法和揮發(fā)油雙提法所得提取液的抗炎鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)。

綜上所述，本研究通過對(duì)比清咽潤喉復(fù)方不同提取方法有效成分含量和抗炎鎮(zhèn)痛效果，證明揮發(fā)油雙提法為該復(fù)方最佳提取方法，為進(jìn)一步的提取工藝和相關(guān)新型產(chǎn)品研究開發(fā)提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。