張文光，馬智慧，孟文文，劉慧茹，趙東升，鄧志鵬，劉江亭，趙 盼

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250300）

天然產(chǎn)物是自然界生物歷經(jīng)幾千年進(jìn)化保留下來的初級或次級代謝產(chǎn)物，研究表明1981 年至2019 年全球上市的藥物有64.9%來自于天然產(chǎn)物［1］。從天然產(chǎn)物中篩選得到的活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)新穎、療效好、不良反應(yīng)少，鑒于其多樣的生物活性和化學(xué)結(jié)構(gòu)，既可以直接開發(fā)為新藥，也可以作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾與優(yōu)化后成為新藥［2］。目前對天然產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)分離、結(jié)構(gòu)鑒定、有效活性成分篩選的方法主要有活性追蹤分離法［3］、柱后生物測定法［4］、前沿親和色譜法［5］等，但存在時間長、勞動強(qiáng)度大、專屬性差、微量活性組分不易檢測、活性成分易丟失等問題，嚴(yán)重阻礙了探尋天然產(chǎn)物中活性成分的步伐。因此，如何從天然產(chǎn)物中快速高效地篩選活性成分，是研究重點(diǎn)。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，藥物與生物大分子的親和性是其發(fā)揮作用的第一步［6］，因此，基于與疾病相關(guān)的生物大分子作為靶標(biāo)進(jìn)行藥物篩選的分子靶向法應(yīng)運(yùn)而生。親和超濾-液質(zhì)聯(lián)用（AUF-LC-MS）技術(shù)是基于溶液的親和性選擇平臺，采用超濾方法分離溶液中的目標(biāo)配體復(fù)合物，是從復(fù)雜天然產(chǎn)物中鑒定活性分子的有力工具。1997 年van Breemen 等［7］使用血清白蛋白和腺苷脫氨酶作為生物分子靶標(biāo)，首次把液相色譜和電噴霧質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用篩選天然產(chǎn)物中的活性成分。親和超濾技術(shù)應(yīng)用于天然產(chǎn)物活性成分篩選，不但克服了傳統(tǒng)篩選方法的缺點(diǎn)，可使天然活性成分的篩選與結(jié)構(gòu)鑒定一步完成，而且能夠有效避免微量活性物質(zhì)的漏篩和雜質(zhì)干擾，可提高篩選結(jié)果的準(zhǔn)確率，現(xiàn)已廣泛用于中藥活性成分研究［8］。

1 流程、原理、應(yīng)用優(yōu)勢

AUF-LC-MS 技術(shù)已成為受體-配體相互作用研究的通用方法，并在挖掘天然產(chǎn)物活性成分中發(fā)揮著越來越重要的作用。其流程為將選定的生物大分子（受體）與待篩選物質(zhì)（靶標(biāo)配體）在某一緩沖溶液中進(jìn)行孵育；然后轉(zhuǎn)移至合適孔徑的超濾管進(jìn)行離心超濾，未與生物大分子結(jié)合的物質(zhì)將被離心至超濾管下層；其次用緩沖溶液洗滌未結(jié)合的配體小分子；最后將含受體-配體復(fù)合物的超濾系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至新的超濾管中，使蛋白變性，解離蛋白，收集下層含有與受體結(jié)合的靶標(biāo)配體成分，隨后用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行靶標(biāo)配體的檢測，從而實現(xiàn)天然產(chǎn)物活性成分的快速篩選［9］。其原理流程見圖1。

圖1 AUF-LC-MS 技術(shù)篩選天然產(chǎn)物活性成分流程圖

AUF-LC-MS 技術(shù)基本原理是基于受體與靶標(biāo)配體的結(jié)合親和力，親和超濾主要分為離心超濾（CU-LC-MS）和脈沖超濾（PU-LC-MS）。目前，離心超濾主要由商品化的超濾離心管實現(xiàn)，由于超濾膜的超低結(jié)合和各向異性，整個篩選過程可以通過多次離心洗脫快速完成。脈沖超濾由流動室、磁力攪拌器和超濾膜組成，將測試樣品和目標(biāo)蛋白加入流動室后，可以通過施加一定的壓力來分離配體-受體復(fù)合物和非活性成分，與傳統(tǒng)的篩選方法相比，具有自動化程度高、可反復(fù)使用受體的優(yōu)點(diǎn)。雖然這2 種技術(shù)都可以用于親和選擇和配體富集，但它們的應(yīng)用因設(shè)備本身相差較大。例如，離心超濾通常用于篩選活性小分子，而脈沖超濾在描述受體-靶標(biāo)配體結(jié)合特征、藥物代謝、產(chǎn)物測定方面更有效。

AUF-LC-MS 技術(shù)是前期處理受體和靶標(biāo)配體，后期進(jìn)入在線檢測，利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析，實驗組的峰強(qiáng)度和峰面積大于對照組，表明化合物特異性結(jié)合到目標(biāo)分子上，這就將高效液相良好的分離能力和質(zhì)譜的分析能力結(jié)合起來。相比于其他篩選檢測方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)，①不需要標(biāo)記或固定目標(biāo)或小分子；②以溶液為基礎(chǔ)，并適合于適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊和穩(wěn)定性所必需的不同緩沖液；③選擇性地從復(fù)雜混合物中鑒定配體，提供多重篩選平臺；④只需要適量的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。

2 影響因素

2.1 受體與靶標(biāo)配體濃度 受體與靶標(biāo)配體濃度是孵育過程中的2 個關(guān)鍵因素，為了獲得良好的結(jié)合結(jié)果，首先對其進(jìn)行方法學(xué)考察。引入了平衡解離常數(shù)KD值，受體與靶標(biāo)配體的KD值應(yīng)當(dāng)相差不大，如果相差較大，容易造成假陽性、假陰性結(jié)果。受體濃度遠(yuǎn)大于配體濃度，易引起非特異性依附，造成假陽性結(jié)果；配體濃度遠(yuǎn)大于受體濃度，配體中的某些活性成分難以融入蛋白，造成假陰性結(jié)果。

2.2 超濾膜 超濾膜的選擇主要涉及2 個方面，①孔徑，對于超濾膜的要求應(yīng)當(dāng)是可以截留相應(yīng)的生物大分子，同時又不會造成漏篩，通常來說孔徑應(yīng)當(dāng)小于生物大分子的三分之一；②材料，最為理想的是對于潛在配體和受體沒有特異性吸附作用，最常用的為纖維素類和聚醚砜類。

2.3 緩沖溶液 緩沖溶液貫穿實驗前期準(zhǔn)備階段，其pH值對生物大分子影響很大，容易造成生物大分子的變性。理想狀態(tài)是可以模擬人體環(huán)境，應(yīng)當(dāng)選擇與人體pH 值相近的緩沖溶液，在使用過程中也應(yīng)當(dāng)注意緩沖溶液的污染問題。

2.4 解離液 能否在整個受體-靶標(biāo)配體體系中解離出特定的活性成分對實驗結(jié)果至關(guān)重要，解離液的選擇是關(guān)鍵因素，一般選擇有機(jī)溶劑作為解離液，例如純甲醇使蛋白變性，將配體與受體解離開。

2.5 其他 除上面幾項關(guān)鍵因素，孵育過程中離心管是否無酶、孵育溫度、時間、離心速度、時間等影響因素均為干擾因素，需要進(jìn)行方法學(xué)考察，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確。

3 應(yīng)用

最近藥理學(xué)研究表明，大多數(shù)藥物通過與疾病相關(guān)的藥物靶點(diǎn)（如酶和受體）相互作用發(fā)揮作用［10］。天然產(chǎn)物通常以其復(fù)雜的化學(xué)成分和多樣化的生物功能為特征。因此，發(fā)現(xiàn)生物活性成分并進(jìn)一步闡明其可能的作用機(jī)制是研究天然產(chǎn)物的2 個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。AUF-LC-MS 結(jié)合了靶向生物分子的親和超濾和液相色譜質(zhì)譜強(qiáng)大的分離分析能力，可以實現(xiàn)高通量篩選和快速鑒定復(fù)雜天然產(chǎn)物中的生物活性成分。在親和超濾過程中，將配體-受體復(fù)合物從未結(jié)合的化合物中分離出來，隨后通過質(zhì)譜分析進(jìn)行定性。在這方面，質(zhì)譜法不僅可以為新藥發(fā)現(xiàn)提供新的思路和方法，而且有助于揭示生物活性成分的作用機(jī)制，由其液質(zhì)檢測靈敏度高、分子量范圍跨度大，在復(fù)雜、微量、未知的天然產(chǎn)物得到靈活應(yīng)用，擴(kuò)大了親和超濾篩選的范圍。此技術(shù)在小分子藥物發(fā)現(xiàn)、中藥成分分析、活性成分追蹤等方面均有較好應(yīng)用，尤其是對于中藥復(fù)方制劑來說，發(fā)揮作用的可能不是單一成分，而是多種成分產(chǎn)生協(xié)同作用的結(jié)果，應(yīng)用AUF-LC-MS 技術(shù)便可快速的定位具體中藥、定位具體成分，是研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的有效途徑。

3.1 天然產(chǎn)物的高通量篩選 該技術(shù)可用于篩選包括α-葡萄糖苷酶［11］、黃嘌呤氧化酶（XOD）［12］、乳酸脫氫酶［13］、酪氨酸酶［14］等的潛在配體。Li 等［13］采用超濾高效液相色譜-光電二極管陣列檢測-電噴霧電離質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對射干提取物中的異黃酮進(jìn)行篩選，鑒定射干中的鳶尾苷、鳶尾苷A、鳶尾苷等為乳酸脫氫酶抑制劑。Ning 等［15］運(yùn)用親和超濾結(jié)合超高效液相色譜和四極桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)從青錢柳葉提取物中鑒定出特定的α-葡萄糖苷酶抑制劑，并從青錢柳葉提取物中鑒定出11 種潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑，體外α-葡萄糖苷酶抑制實驗證實，槲皮素、山柰酚等提取物是α-葡萄糖苷酶抑制活性的主要成分。Liu 等［16］采用AUF-LC-MS 法對丹參提取物中潛在的XOD 抑制劑進(jìn)行篩選和鑒定，從提取物中鑒定出11 種親脂性二萜奎寧為XOD抑制劑。Xie 等［17］成功建立了基于5-LOX／COX-2 酶親和力的生物活性化合物鑒定和篩選的AUF-LC-MS 方法，從知母提取物中獲得5 個生物活性化合物，為后續(xù)多靶點(diǎn)藥物篩選提供參考。詳見表1。

表1 親和超濾技術(shù)篩選天然產(chǎn)物活性成分表

續(xù)表1

續(xù)表1

3.2 中藥復(fù)方制劑中潛在活性成分篩選 Zhang 等［78］以α-葡萄糖苷酶為例，建立超濾液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜快速鑒定參芪降糖顆粒中生物活性成分的方法，從篩選單一天然產(chǎn)物中的活性成分推及到中藥復(fù)方制劑，篩選出的α-葡萄糖苷酶抑制劑候選藥物為開發(fā)和設(shè)計高效抗糖尿病藥物的應(yīng)用提供參考。詳見表2。

表2 親和超濾技術(shù)篩選復(fù)方制劑活性成分表

3.3 天然產(chǎn)物代謝途徑分析和評價藥物的代謝穩(wěn)定性 對通過AUF-LC-MS 技術(shù)篩選得到的活性成分進(jìn)行體外代謝研究，從而推斷出可能的代謝途徑。Huang 等［87］采用AUFLC-MS 技術(shù)對防風(fēng)中LOX 抑制劑進(jìn)行篩選，成功鑒定得到升麻素苷、5-O-甲維阿斯米醇、亥茅酚苷和亥茅酚，利用其有效成分對CYP450 的代謝進(jìn)行研究，獲得3 種染色質(zhì)可能的代謝途徑。AUF-LC-MS 聯(lián)合其他技術(shù)不僅可篩選天然產(chǎn)物中LOX 抑制劑，還可以推斷可能的代謝途徑。Young等［88］運(yùn)用脈沖超濾技術(shù)將細(xì)胞素P450 酶和8 種β 阻斷藥物進(jìn)行混合分析，可以通過與孵育過程中其他化合物的比較來評估每個化合物的相對代謝穩(wěn)定性。這種方法可能適用于根據(jù)代謝穩(wěn)定性對藥物先導(dǎo)物的定向庫進(jìn)行排序，為進(jìn)一步天然產(chǎn)物的開發(fā)選擇先導(dǎo)化合物。

AUF-LC-MS 技術(shù)具有可提供藥物靶標(biāo)和化合物之間的高通量結(jié)合信息的優(yōu)點(diǎn)，適用于組成復(fù)雜的天然產(chǎn)物提取物，還能與分子對接、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等新興技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，進(jìn)一步驗證配體-受體結(jié)合位點(diǎn)。鑒定有效的酶抑制劑／激動劑作為候選藥物已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究的重要目標(biāo)之一［4］?？偨Y(jié)來看，未來的研究方向為①某種酶發(fā)揮抑制作用研究較多，發(fā)揮激動作用的研究不足百分之一；②國內(nèi)外對某一個天然產(chǎn)物研究的較多，大多集中在中藥方面，對復(fù)方制劑、代謝產(chǎn)物的研究較少，還處在起步階段；③由于天然產(chǎn)物成分的復(fù)雜性，某單一的活性成分是否可以和多個靶標(biāo)相互作用還有待研究；④就某一個天然產(chǎn)物單靶標(biāo)研究的較多，對于多靶標(biāo)的探索還有待增加。

4 結(jié)語與展望

天然產(chǎn)物中有效成分的快速篩選是新藥研發(fā)的重要一環(huán)，篩選的方法有親和超濾-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、磁性微球垂釣法、細(xì)胞膜親和色譜法、固定化酶法、在線生物測定法［4］等。AUF-LC-MS 技術(shù)相對于其他篩選方法來說具有篩選速度快、結(jié)果準(zhǔn)確性高、有效避免微量活性物質(zhì)的漏篩和雜質(zhì)干擾等優(yōu)點(diǎn)，然而也有非常突出的局限性，比如小分子與靶標(biāo)的非功能位點(diǎn)結(jié)合或超濾膜的非特異性結(jié)合導(dǎo)致假陽性結(jié)果等。解決方法是將正常酶變性作為對照，進(jìn)入液質(zhì)進(jìn)行檢測，比較化合物與正常和變性酶的峰面積，以排除假陽性結(jié)果。同時，酶活性實驗和分子對接技術(shù)排除了許多潛在的非特異性結(jié)合化合物，有效地提高了親和超濾-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)篩選的準(zhǔn)確性和效率。

從目前來看，AUF-LC-MS 技術(shù)雖然可以快速地篩選出特定的化合物，但仍面臨許多挑戰(zhàn)，例如親和超濾-液質(zhì)聯(lián)用從天然產(chǎn)物中篩選活性成分方面仍然主要針對1 個或2個靶標(biāo)，關(guān)于多靶標(biāo)篩選的報道很少，而發(fā)現(xiàn)多靶標(biāo)抑制劑／激動劑更能滿足現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的要求。同時，高通量液質(zhì)聯(lián)用篩選多種蛋白質(zhì)靶標(biāo)的技術(shù)也有望在不久的將來實現(xiàn)。

綜上所述，無論是為了藥物的發(fā)現(xiàn)還是為了更好地理解一系列人類疾病的發(fā)病機(jī)制，探索更多未知疾病相關(guān)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，都對AUF-LC-MS 技術(shù)提出了更高的要求，相信該技術(shù)將在進(jìn)一步研究天然產(chǎn)物中活性成分的篩選發(fā)揮更重要的作用。