王柳瓔，郭煥佳，姬生國(guó)

（廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510000）

鐵皮石斛來(lái)源于蘭科石斛屬鐵皮石斛Dendrobium officinaleKimura et Migo.的干燥莖，具有益胃生津、滋陰清熱作用［1］，分布于我國(guó)安徽、浙江、云南等地［2］。2020 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定鐵皮石斛的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)為多糖和甘露糖，其中多糖含量不得少于25%，甘露糖含量為13%～38%。鐵皮石斛多糖具有抗腫瘤［3-4］、降血壓［5］、降血糖［6］、降血脂［7］作用，而甘露糖是鐵皮石斛多糖組成的主要單糖，對(duì)腫瘤、糖尿病、肥胖病都具有治療作用［8-9］。隨著人工栽培技術(shù)的成熟，鐵皮石斛的種植面積開(kāi)始擴(kuò)大，不同產(chǎn)區(qū)栽培的鐵皮石斛質(zhì)量存在差異。目前采用傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別或建立藥材指紋圖譜等方法對(duì)鐵皮石斛質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，不夠全面［10］?；疑P(guān)聯(lián)分析是多種因素統(tǒng)計(jì)分析的一類方法，它是以各因素的樣本數(shù)據(jù)為依據(jù)，用灰色關(guān)聯(lián)度來(lái)衡量各因素間關(guān)聯(lián)性大?。?1］。本研究采用熵權(quán)法和灰色關(guān)聯(lián)度法相結(jié)合的質(zhì)量評(píng)價(jià)模型，以鐵皮石斛多糖、甘露糖的含量、水分、總灰分和醇溶性浸出物作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行研究。

1 材料

1120 型高效液相色譜儀、BIY211b 萬(wàn)分之一電子天平、AY120 十萬(wàn)分之一電子天平（日本島津公司）；UV1102 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海天美股份有限公司）；DELTA D150 型超聲清洗器（上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司）。

20 批鐵皮石斛樣品為2020 年7 月至8 月期間采自廣東省、湖南省、四川省等栽培基地，詳見(jiàn)表1，經(jīng)廣東農(nóng)科院環(huán)藝所王再花副研究員鑒定為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛Dendrobium officinaleKimura et Migo。除去鐵皮石斛葉，莖經(jīng)105 ℃殺青15 min，60 ℃干燥后粉碎，過(guò)50 目篩，保存在自封袋中，置于干燥器中備用。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

無(wú)水葡萄糖（批號(hào)110833-202005）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甘露糖（批號(hào)140651-202002）購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。甲酸、乙腈、乙酸銨為色譜純；其他試劑均為分析純；水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖含量測(cè)定 精密稱取無(wú)水葡萄糖0.100 0 g，用水溶解并定容至100 mL。取10 mL 溶液至100 mL量瓶，用水稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為100 μg／mL 的對(duì)照品溶液。

精密稱取樣品0.300 0 g，加入200 mL 水，加熱回流提取2 h，放冷，提取液轉(zhuǎn)移至250 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過(guò)。精密量取2 mL 續(xù)濾液，置于15 mL 離心管中，精密加入無(wú)水乙醇10 mL，充分搖勻，置于4 ℃冰箱中冷藏1 h，離心20 min，棄去上清液，沉淀物用80% 乙醇洗滌2次，每次8 mL，離心，沉淀物加水溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

精密量取多糖對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，置于10.0 mL 具塞試管中，加蒸餾水至1.0 mL，精密加入1 mL 5%苯酚溶液，搖勻，加入濃硫酸5.0 mL，于95 ℃水浴加熱20 min。以1.0 mL 蒸餾水作為空白對(duì)照，于488 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得回歸方程為Y＝ 0.008 737X＋0.005 2，r＝0.999 6。結(jié)果表明多糖在10～80 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密量取供試品溶液0.4 mL 置于10 mL 具塞玻璃試管中，加水至1.0 mL 后測(cè)定。

2.2 甘露糖含量測(cè)定 色譜條件為ODS-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.02 mol／L乙酸銨（20∶80），等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；體積流量1 mL／min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

精密稱取10 mg 甘露糖，置于100 mL 量瓶中，用水溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為100 μg／mL 的甘露糖對(duì)照品溶液。

精密稱取樣品粉末0.120 0 g，置于索氏提取器中，加入25 mL 80% 乙醇，加熱回流提取4 h，棄去乙醇，將粉末取出揮干溶劑，置于具塞錐形瓶中，加入100 mL 水，加熱煎煮1 h，放冷，用水補(bǔ)足至100 mL，離心，吸取上清液1 mL 置于具塞玻璃管中，加入0.5 mL 3.0 mol／L 鹽酸，封口，混勻，置于沸水浴中水解1 h，放冷，用3.0 mol／L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至中性。吸取400 μL，加入0.5 mol／L 1-苯基-3-甲基-5 吡唑啉酮甲醇溶液和0.3 mol／L 氫氧化鈉溶液各400 μL，充分混勻，70 ℃水浴反應(yīng)100 min，放冷，加入500 μL 0.3 mol／L鹽酸，混勻。用三氯甲烷洗滌3 次，棄去三氯甲烷層，水層離心后吸取其上清液，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

精密吸取對(duì)照品溶液 25.000、10.000、2.500、1.250、0.625、0.500、0.250、0.150 mL，分別置于100 mL 量瓶中定容，測(cè)定甘露糖的峰面積，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)（X），峰面積為橫坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得回歸方程為Y＝9 798.398 9X＋1.105 1，r＝0.999 9，在0.15～25 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，色譜圖見(jiàn)圖1，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 指標(biāo)成分的測(cè)定 參照2020 年版《中國(guó)藥典》 通則0832 水分測(cè)定法中的第二法“烘干法”、通則2302 灰分測(cè)定法中的總灰分測(cè)定法及通則2201 項(xiàng)下醇溶性浸出物測(cè)定法中的熱浸法對(duì)鐵皮石斛中水分、總灰分、醇溶性浸出物進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果均符合藥典規(guī)定，見(jiàn)表2。

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of content determination of various constituents

2.4 熵權(quán)法計(jì)算權(quán)重 設(shè)有n個(gè)樣品，每個(gè)樣品有m項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，由此組成單元序列｛Xij｝（i＝1、2、3……n；j＝1、2、3……m；n為20，m為5）［12-13］。

2.4.2 各指標(biāo)的信息熵 計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的信息熵Ej，公式為式中Ej為樣品第j個(gè)指標(biāo)的信息熵，若Pij＝0，則定義ln（Pij）＝0。

2.4.3 確定各指標(biāo)權(quán)重 確定各指標(biāo)的信息熵后，計(jì)算各指標(biāo)的權(quán)重（Wj），公式為Wj ＝。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 信息熵及權(quán)重Tab.3 Information entropies and weights

2.5 灰色關(guān)聯(lián)度法計(jì)算各指標(biāo)相對(duì)關(guān)聯(lián)度 設(shè)有n個(gè)樣品，每個(gè)樣品有m項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，由此組成單元序列 ｛Xik｝（i＝1、2、3……n；k＝ 1、2、3……m；n為20，m為5），從質(zhì)量評(píng)價(jià)的角度出發(fā)，水分和總灰分越低越好，多糖和甘露糖含量越高越好，對(duì)水分和總灰分兩個(gè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行倒數(shù)轉(zhuǎn)換［14］，評(píng)價(jià)指標(biāo)統(tǒng)一后，將n個(gè)樣品各項(xiàng)對(duì)應(yīng)指標(biāo)的最大值｛Xsk｝ 計(jì)為最優(yōu)參考序列，n個(gè)樣品各項(xiàng)對(duì)應(yīng)指標(biāo)的最小值｛Xtk｝ 計(jì)為最差參考序列。

2.5.2 關(guān)聯(lián)系數(shù)計(jì)算 采用相應(yīng)公式計(jì)算相對(duì)于最優(yōu)參考序列｛Xsk｝ 和最差參考序列｛Xtk｝的關(guān)聯(lián)系數(shù)［15］，，式中Δmin＝min｜Yik－Ysk｜；Δmax＝max｜Yik－Ysk｜；i＝1，2，3，…，n；k＝1，2，3，…，m；ρ稱為分辨系數(shù)，此次取值為計(jì)算獲得的各項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各評(píng)價(jià)單元的關(guān)聯(lián)系數(shù)Tab.4 Correlation coefficients for each evaluation unit

2.5.3 關(guān)聯(lián)度計(jì)算 分別采用相應(yīng)公式計(jì)算相對(duì)于最優(yōu)參考序列｛Xsk｝ 和最差參考序列｛Xtk｝的關(guān)聯(lián)度，

2.5.4 相對(duì)關(guān)聯(lián)度的計(jì)算 按公式計(jì)算各評(píng)價(jià)單元的相對(duì)關(guān)聯(lián)度，，式中i ＝1，2……n。

根據(jù)相對(duì)關(guān)聯(lián)度的大小對(duì)評(píng)價(jià)單元序列進(jìn)行排序，最終得到優(yōu)劣評(píng)價(jià)結(jié)果。結(jié)合熵權(quán)法結(jié)果，各樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同批次鐵皮石斛相對(duì)關(guān)聯(lián)度Tab.5 Relative correlation degrees of different batches of D.officinale

2.5.5 鐵皮石斛的質(zhì)量排序 對(duì)鐵皮石斛多糖、甘露糖含量、水分、總灰分及醇溶性浸出物結(jié)果進(jìn)行排序［16］，并使用灰色關(guān)聯(lián)度法及熵權(quán)法結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度法對(duì)20 批不同產(chǎn)地鐵皮石斛進(jìn)行質(zhì)量排序，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同批次鐵皮石斛質(zhì)量排序Tab.6 Quality ranking for different batches of D.officinale

3 討論

本研究構(gòu)建熵權(quán)法結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度法評(píng)價(jià)鐵皮石斛質(zhì)量模型，結(jié)果表明不同批次的鐵皮石斛藥材樣品之間的相對(duì)關(guān)聯(lián)度在0.228 2～0.496 0，說(shuō)明不同產(chǎn)地之間存在質(zhì)量差異，其中S1～S10 樣品采集于廣東省廣州市栽培基地，各樣品之間最小相對(duì)關(guān)聯(lián)度為0.244 7，最高相對(duì)關(guān)聯(lián)度為0.373 4。結(jié)果表明，樣品采集于相同產(chǎn)地，但由于栽培環(huán)境、培植方法及養(yǎng)護(hù)方法等的不同，對(duì)鐵皮石斛藥材的質(zhì)量會(huì)造成一定影響。

對(duì)樣品排序及以灰色關(guān)聯(lián)度法和以熵權(quán)結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度法進(jìn)行分析，樣品S3 中總灰分及甘露糖含量均排第一，其在灰色關(guān)聯(lián)度分析及綜合分析評(píng)價(jià)中均排在第六；樣品S12 中水分含量排第一，其在灰色關(guān)聯(lián)度分析及綜合分析評(píng)價(jià)中均排在第二十；樣品S13 中多糖含量排第一，其在灰色關(guān)聯(lián)度分析及綜合分析評(píng)價(jià)中均排在第四；樣品S16 在灰色關(guān)聯(lián)度分析及綜合分析評(píng)價(jià)中均排第一。水分和總灰分的含量越高其質(zhì)量越差，相反醇溶性浸出物、多糖和甘露糖含量越高其質(zhì)量越優(yōu)。但是灰色關(guān)聯(lián)度法分析結(jié)果和熵權(quán)結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度法分析的綜合評(píng)價(jià)排序不一致，是因?yàn)榛疑P(guān)聯(lián)度法中各指標(biāo)的ρ一直采用的是經(jīng)驗(yàn)值0.5，即各指標(biāo)權(quán)重相同，無(wú)法體現(xiàn)各個(gè)指標(biāo)對(duì)整體質(zhì)量的影響程度，在質(zhì)量評(píng)價(jià)上并不能做到客觀全面［17-18］。結(jié)合熵權(quán)法以后，以熵值來(lái)判斷某個(gè)指標(biāo)的離散程度，信息熵值越小，指標(biāo)的離散程度就越大，則該指標(biāo)對(duì)綜合評(píng)價(jià)的影響（即權(quán)重）就越大［19］。經(jīng)熵權(quán)法獲得鐵皮石斛中水分、灰分、浸出物、多糖、甘露糖含量的熵值分別為0.825 9、0.842 7、0.723 7、0.766 9、0.796 5。多糖及甘露糖含量的熵值較小，說(shuō)明這2 種指標(biāo)的含量對(duì)藥材質(zhì)量影響的權(quán)重最大。

本研究以水分、灰分、浸出物、多糖、甘露糖含量為指標(biāo)，通過(guò)熵權(quán)結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度法對(duì)鐵皮石斛藥材質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)分析，相對(duì)于單一指標(biāo)的評(píng)價(jià)較為科學(xué)，為建立科學(xué)、可靠的鐵皮石斛藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供了參考。