張 玲，李宗金，，張亞莉，胡 丹，王 丹，向 莉

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012； 2.江蘇正大豐海制藥有限公司，江蘇 南京 210000；3.湖北長(zhǎng)陽(yáng)土家族自治縣農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)服務(wù)中心，湖北 宜昌 443500）

木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai 的干燥近成熟果實(shí)，具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕之功效［1］?！八嵛丁?是木瓜質(zhì)量評(píng)價(jià)的一個(gè)重要特征?！吨腥A本草》［2］記載：“木瓜，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，味酸者為佳?！?有機(jī)酸是構(gòu)成中藥酸味的主要成分［3］。宣木瓜中總有機(jī)酸含量約為20%，水溶性有機(jī)酸含量約為1.5%，三萜酸含量約為0.5%［4］。蘋(píng)果酸與檸檬酸是木瓜各產(chǎn)地品種酸味差異高低的主要決定因子［5］。木瓜水提液pH值與可滴定總有機(jī)酸量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)［6］。但構(gòu)成木瓜酸味的主要有機(jī)酸成分目前未見(jiàn)報(bào)道。

電子舌可模擬人體味覺(jué)系統(tǒng)，從味覺(jué)傳感器的化學(xué)信號(hào)分析出“味道” 信息并進(jìn)行識(shí)別檢測(cè)［7］。電子舌在茶葉、食品和中藥等［8-16］領(lǐng)域均有應(yīng)用。本研究運(yùn)用電子舌技術(shù)獲得不同產(chǎn)地木瓜水提液和有機(jī)酸的味覺(jué)信息值，采用電位滴定法測(cè)定木瓜中總有機(jī)酸的含量，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定12 種有機(jī)酸含量，分析木瓜水提液酸味值與有機(jī)酸成分的相關(guān)性，為研究木瓜酸味的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料

SA402B 型智能味覺(jué)分析系統(tǒng)（日本Insent 公司）；LC20A 型島津超高效液相色譜儀（日本島津公司）；TRIPLE QUAD4500 型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)SCIEX 公司）。

蘋(píng)果酸（批號(hào) 180903）、檸檬酸（批號(hào)141027）、奎寧酸（批號(hào)190123）、莽草酸（批號(hào)180104）、綠原酸（批號(hào)170713）、原兒茶酸（批號(hào)180929）對(duì)照品購(gòu)于成都克洛瑪生物科技有限公司；琥珀酸（批號(hào)110156）、富馬酸（批號(hào)110178）對(duì)照品購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；咖啡酸（批號(hào)140428）、肉桂酸（批號(hào)180612）、齊墩果酸（批號(hào)121213）、熊果酸（批號(hào)141118）對(duì)照品購(gòu)于成都普菲德生物科技有限公司。甲醇、醋酸、甲酸均為質(zhì)譜純；其余試劑為分析純；水為超純水。

20 批木瓜藥材樣品分別采自安徽宣城（宣木瓜，S1～S7）、湖北長(zhǎng)陽(yáng)（資丘木瓜，S8～S16）和安徽亳州康美中藥材市場(chǎng)（S17～S20），經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊俊教授鑒定S1～S17為正品，S18、S19為毛葉木瓜，S20為光皮木瓜。

2 方法

2.1 總有機(jī)酸含量測(cè)定 取木瓜粉末（過(guò)3 號(hào)篩）約2.5 g，精密稱定，置100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入水50 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻至室溫，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL。按電位滴定法［17-18］，用NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以蘋(píng)果酸（C4H6O5）計(jì)算樣品中總有機(jī)酸含量。

2.2 有機(jī)酸含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 取各對(duì)照品溶液適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL 含檸檬酸1.00 mg，莽草酸2.42 mg，蘋(píng)果酸1.73 mg，咖啡酸1.23 mg，綠原酸0.92 mg，奎寧酸0.86 mg，琥珀酸 0.84 mg，原兒茶酸 2.05 mg，肉桂酸1.12 mg，富馬酸0.90 mg，齊墩果酸1.37 mg，熊果酸1.12 mg 的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取木瓜粉末（過(guò)3 號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）20 min，冷卻至室溫，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液1 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 分析條件 色譜條件為ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相0.3%甲酸甲醇（A）-0.3%甲酸（B），梯度洗脫（0～9 min，10% B；9～13 min；10%～30% B；13～15 min，30%～95% B；15～16 min，95% B）；體積流量0.2 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；源噴射電壓（IS）－4 500 V；離子源溫度550 ℃；負(fù)離子檢測(cè)；霧化氣（GS1）壓力55 kPa；輔助氣（GS2）壓力55 kPa；氣簾氣（N2）壓力33 kPa；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。12 種有機(jī)酸成分監(jiān)測(cè)的離子對(duì)、解簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）見(jiàn)表1，對(duì)照品和供試品MRM 色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品溶液（A）和供試品溶液（B）MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of the reference solution（A）and the sample solution（B）

表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters of various constituents

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，12 種有機(jī)酸在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取同一批木瓜供試品溶液，在“2.2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，12 種有機(jī)酸峰面積RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號(hào)為S2的木瓜粉末約0.5 g，精密稱定，平行6 份，分別在“2.2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，12 種有機(jī)酸含量RSD 均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一批木瓜供試品溶液，依次于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.2.3” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，12 種有機(jī)酸含量RSD 均小于3%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取編號(hào)為S2的木瓜粉末約0.25 g，精密稱定，平行6 份，按照1∶1 分別加入對(duì)照品，制備供試品溶液，分別在“2.2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，12 種有機(jī)酸平均加樣回收率為88%～102%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 電子舌測(cè)定

2.3.1 木瓜水提液制備 取木瓜粉末（過(guò)3 號(hào)篩）約3.0 g，精密稱定，置100 mL 具塞錐形瓶中，加水100 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，濾過(guò)，濾液置100 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取蘋(píng)果酸、檸檬酸、奎寧酸、莽草酸、原兒茶酸、綠原酸、肉桂酸、富馬酸、咖啡酸、琥珀酸對(duì)照品適量，加水分別制成濃度為1×10－4mol／L 的對(duì)照品溶液。

2.3.3 測(cè)定方法 氯化鉀和酒石酸加水配制成基準(zhǔn)液。傳感器在正、負(fù)極清洗液和基準(zhǔn)液中清洗、平衡后開(kāi)始檢測(cè)，取后3 次試驗(yàn)結(jié)果平均值作為檢測(cè)結(jié)果。以基準(zhǔn)液味覺(jué)值為無(wú)味點(diǎn)，味覺(jué)值大于無(wú)味點(diǎn)，樣品中有該味道；低于無(wú)味點(diǎn)則樣品沒(méi)有該味道。

3 結(jié)果

3.1 木瓜總有機(jī)酸和單體有機(jī)酸含量 20 批木瓜樣品中總有機(jī)酸和12 種單體有機(jī)酸的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。宣木瓜總有機(jī)酸含量范圍為4.8%～10%，資丘木瓜為2.4%～8.7%，毛葉木瓜為3.6%～6.1%，光皮木瓜為1.1%。12 種有機(jī)酸含量較高的為蘋(píng)果酸、奎寧酸，含量較低的為富馬酸、琥珀酸、咖啡酸和肉桂酸。

表3 總有機(jī)酸和有機(jī)酸含量測(cè)定結(jié)果（%）Tab.3 Results of content determination of total organic acid and organic acid（%）

3.2 木瓜水提液味覺(jué)信息值 電子舌測(cè)定的味覺(jué)信息值結(jié)果見(jiàn)表4、圖2。不同木瓜水提液中味覺(jué)差異主要體現(xiàn)在酸味，其次是苦味、甜味和鮮味。宣木瓜的酸味和苦味高于資丘木瓜，甜味低于資丘木瓜；光皮木瓜相較于其他木瓜，有明顯的甜味、苦味和較弱的酸味。

圖2 木瓜水提液味覺(jué)信息雷達(dá)圖Fig.2 Radar diagram for taste information of water extract of C.Fructus

表4 電子舌味覺(jué)信息值Tab.4 Information values of electronic tongue tastes

3.3 有機(jī)酸味覺(jué)信息值 有機(jī)酸對(duì)照品溶液味覺(jué)信息值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。10 種水溶性有機(jī)酸均呈現(xiàn)出苦味、澀味和鮮味。只有6 種有機(jī)酸呈現(xiàn)出酸味，其中檸檬酸酸味最強(qiáng)，其次是蘋(píng)果酸、莽草酸、奎寧酸、富馬酸和綠原酸，而原兒茶酸、肉桂酸、咖啡酸和琥珀酸不呈現(xiàn)酸味。

表5 有機(jī)酸對(duì)照品溶液電子舌測(cè)定結(jié)果Tab.5 Results for electronic tongue test of organic acid reference substance solutions

3.4 木瓜水提液味覺(jué)信息值與有機(jī)酸的相關(guān)性分析 將不同木瓜樣品水提液味覺(jué)信息值和有機(jī)酸含量導(dǎo)入SPSS 23.0 軟件，進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性顯著性（雙尾）分析，結(jié)果見(jiàn)表6。木瓜水提液酸味值與總有機(jī)酸、富馬酸、綠原酸、奎寧酸和原兒茶酸含量呈正相關(guān)，與莽草酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸含量呈顯著性正相關(guān)。

表6 木瓜水提液味覺(jué)值與有機(jī)酸相關(guān)性Tab.6 Correlation between the taste information values of water extract of C.Fructus and organic acids

4 討論

宣木瓜和資丘木瓜為木瓜正品，毛葉木瓜和光皮木瓜為木瓜偽品。本研究發(fā)現(xiàn)，木瓜正品和偽品味覺(jué)構(gòu)成上有明顯差異，宣木瓜和資丘木瓜水提液味覺(jué)值以酸、苦、澀為主，毛葉木瓜以酸、苦、甜為主，光皮木瓜以甜、苦、酸為主。與資丘木瓜相比，宣木瓜的酸味和苦味較強(qiáng)，且沒(méi)有甜味，而部分資丘木瓜樣品可以測(cè)出甜味。

綜合考慮木瓜中有機(jī)酸的含量、單體有機(jī)酸味覺(jué)值以及木瓜水提液酸味值與有機(jī)酸含量的相關(guān)性，認(rèn)為構(gòu)成木瓜酸味的主要有機(jī)酸成分為蘋(píng)果酸、奎寧酸、檸檬酸、莽草酸和綠原酸。中藥五味理論指導(dǎo)著中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用［19］，酸味不僅是木瓜的性狀味，也是木瓜的功效味，是木瓜質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。本研究?jī)H對(duì)木瓜中酸味與有機(jī)酸的相關(guān)性進(jìn)行分析，后續(xù)將對(duì)木瓜其他成分進(jìn)行研究，為進(jìn)一步明確木瓜酸味物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。