翁麗麗，曾行調(diào)，王孟聰，種湘歌，李宜平

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117）

北蒼術(shù)Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.為菊科多年生草本植物，主產(chǎn)于河北、吉林、遼寧等地，具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目等功效［1-2］。揮發(fā)油是北蒼術(shù)的主要化學(xué)成分，包括蒼術(shù)素、蒼術(shù)酮、β-桉葉醇等，是其發(fā)揮療效的藥用物質(zhì)基礎(chǔ)，具有抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等藥理作用［3-4］。

目前國(guó)內(nèi)外北蒼術(shù)需求量不斷增加，華北、東北地區(qū)北蒼術(shù)野生資源由于過(guò)度采挖而被破壞，北蒼術(shù)野生品蘊(yùn)藏量急劇下降。栽培品逐漸取代野生品成為市場(chǎng)主流，但由于種植技術(shù)不規(guī)范、產(chǎn)地差異及偽品、劣品的出現(xiàn)，導(dǎo)致市場(chǎng)上北蒼術(shù)質(zhì)量參差不齊。因此，建立全面合理的北蒼術(shù)藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方法尤為重要。近年來(lái)，對(duì)北蒼術(shù)進(jìn)行指紋圖譜和整體質(zhì)量評(píng)價(jià)研究較少［5-6］。指紋圖譜通過(guò)對(duì)化學(xué)成分群的整體反映，可全面、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)北蒼術(shù)藥材的內(nèi)在質(zhì)量。同時(shí)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的應(yīng)用為北蒼術(shù)內(nèi)在機(jī)制及其整體研究提供思路，為預(yù)測(cè)其功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)及闡釋作用機(jī)制提供技術(shù)支持。

本研究建立北蒼術(shù)藥材指紋圖譜，并結(jié)合主成分分析確認(rèn)引起北蒼術(shù)質(zhì)量差異的主要成分，基于化學(xué)模式特征性地識(shí)別指紋圖譜的數(shù)據(jù)和變量，在此基礎(chǔ)上結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析北蒼術(shù)的功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)及作用機(jī)制，以期全面控制和評(píng)價(jià)北蒼術(shù)藥材質(zhì)量。

1 材料

LC2030 型液相色譜儀、AUW 120D 分析天平（日本島津公司）；FA1004B 電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；KQ3200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

蒼術(shù)素對(duì)照品（批號(hào)111924-201806），購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；綠原酸（批號(hào)110753-202018）、β-桉葉醇（批號(hào)P24O8F46474）、蒼術(shù)酮（批號(hào)P11M10F73437）對(duì)照品均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。磷酸、乙腈為色譜純；甲醇為分析純；水為超純水。

本實(shí)驗(yàn)收集吉林、河北、內(nèi)蒙等地北蒼術(shù)藥材22 批，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)翁麗麗教授鑒定為菊科植物北蒼術(shù)Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.的干燥根莖，藥材信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，15% A；10～20 min，15%～30%A；20～30 min，30%～45%A；30～40 min，45%～55%A；40～65 min，55%～55%A；65～75 min，55%～70% A；75～100 min，70%～90% A）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)208 nm（55～70 min）、220 nm（81～100 min）、304 nm（0～55、70～81 min）；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取綠原酸、β-桉葉醇、蒼術(shù)素、蒼術(shù)酮適量，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為0.018 6、0.016 0、0.005 0、0.012 4 mg／mL 的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液制備 北蒼術(shù)藥材粉碎過(guò)3 號(hào)篩，取0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）1 h，放冷，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 主成分分析 使用SPSS 22.0 軟件，以22 批北蒼術(shù)的共有峰峰面積為變量，進(jìn)行主成分分析（主成分因子篩選標(biāo)準(zhǔn)，λ＞1），在盡可能保留原有信息量的前提下，降維分析起主導(dǎo)作用的重要成分，以此反映出決定類(lèi)別的關(guān)鍵因素。

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.3.1 候選成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及“成分-靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）檢索預(yù)測(cè)成分的化合物，獲取北蒼術(shù)候選成分的靶點(diǎn)信息；在PubChem Compound 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索北蒼術(shù)預(yù)測(cè)成分化合物的SMILES 結(jié)構(gòu)，通過(guò)Swiss Target Prediction 服務(wù)器進(jìn)行北蒼術(shù)候選成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。

2.3.2 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)將“2.3.1” 項(xiàng)下篩選出的靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 分析，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，蛋白交互參數(shù)評(píng)分值為“high confidence＞0.7”，獲得核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件進(jìn)行相關(guān)信息獲得和結(jié)構(gòu)優(yōu)化。

2.3.3 GO 功能富集 對(duì)“2.3.1” 項(xiàng)下獲得的作用靶點(diǎn)利用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 富集分析。以P＜0.05 進(jìn)行篩選，并根據(jù)P值從小到大排序獲取GO 條目。

2.3.4 KEGG 通路富集 利用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)“2.3.1” 項(xiàng)下獲得的核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，P值越小，顯著性越強(qiáng)。將P值由小到大排序，利用微生物繪圖平臺(tái)（http：／ ／www.bioinformatics.com.cn／）將信號(hào)通路可視化。

2.3.5 “成分-靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過(guò)Cytoscape3.7.2 軟件，將北蒼術(shù)成分、靶點(diǎn)、信號(hào)通路相互作用的相關(guān)數(shù)據(jù)制成“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

3 結(jié)果

3.1 HPLC 指紋圖譜分析

3.1.1 參照峰的選擇 在北蒼術(shù)藥材的指紋圖譜中，蒼術(shù)素的色譜峰分離度符合要求、峰面積和保留時(shí)間適中，且為所有樣品的共有峰之一，因此選擇蒼術(shù)素為參照峰。

3.1.2 方法學(xué)考察 按“2.1.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性考察，取同一北蒼術(shù)供試品溶液（批號(hào)CZ-1），以14 號(hào)峰（蒼術(shù)素）為參照峰，記錄各色譜圖，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果均＜3.0%，表明儀器精密度、方法重復(fù)性、供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性均良好［7］。

3.1.3 HPLC 指紋圖譜的建立 取22 批北蒼術(shù)藥材，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，參照?qǐng)D譜為S1 號(hào)樣品的HPLC 色譜圖，時(shí)間窗寬度為0.1 min，多點(diǎn)校正法匹配22 批北蒼術(shù)藥材的全譜峰，平均數(shù)法生成北蒼術(shù)藥材的對(duì)照?qǐng)D譜，指紋圖譜疊加圖見(jiàn)圖1。22 批北蒼術(shù)標(biāo)定18 個(gè)共有峰，見(jiàn)圖2。通過(guò)與對(duì)照品（圖3）圖譜比對(duì)，3 號(hào)峰為綠原酸，13 號(hào)峰為β-桉葉醇，14號(hào)峰為蒼術(shù)素，17 號(hào)峰為蒼術(shù)酮。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，22 批北蒼術(shù)藥材的指紋圖譜相似度良好，其中18 批藥材的相似度大于0.9，說(shuō)明所選不同產(chǎn)地的北蒼術(shù)藥材指紋圖譜較穩(wěn)定。

圖1 22 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of twenty-two batches of samples

圖2 HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

圖3 對(duì)照品HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of references

3.2 主成分分析 由表2 可知，5 個(gè)主成分被提取，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到87.78%，圖4 輔助判斷5 個(gè)主成分因子應(yīng)該被提取，表明提取出的5 個(gè)主成分可以代表北蒼術(shù)樣品的大部分信息內(nèi)容，可用于評(píng)價(jià)北蒼術(shù)質(zhì)量。由表3 可知，第1 主成分反映指紋圖譜中1、4、5、8、12、13、17 號(hào)峰信息，共有峰峰面積的變化可反映樣品共有峰的整體變化，表明樣品中13（β-桉葉醇）、17（蒼術(shù)酮）號(hào)共有峰對(duì)應(yīng)成分的含量變化是導(dǎo)致藥材質(zhì)量差異的重要因素；第2 主成分主要反映6、14（蒼術(shù)素）、15 號(hào)峰的信息；第3 主成分主要反映3（綠原酸）、9、11、18 號(hào)峰信息，3 個(gè)主成分可以反映88.89%的共有峰信息。以3 個(gè)主成分為變量得到載荷圖，見(jiàn)圖5，且β-桉葉醇（峰13）有較大的權(quán)重值，說(shuō)明其在22 批北蒼術(shù)藥材中比較穩(wěn)定，對(duì)主成分的貢獻(xiàn)率最大，在決定不同批次間北蒼術(shù)藥材質(zhì)量差異上起到重要作用。

圖5 主成分因子載荷圖Fig.5 Load diagram of principal component factor

表3 初始因子載荷矩陣Tab.3 Initial factor load matrix

圖4 22 批北蒼術(shù)碎石圖Fig.4 Scree plot of 22 batches of A.chinensis

表2 特征值和累計(jì)方差貢獻(xiàn)率Tab.2 Eigenvalue and cumulative variance contribution rate

3.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.3.1 候選成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及“成分-靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 獲取預(yù)測(cè)的北蒼術(shù)功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)蒼術(shù)素、β-桉葉醇、蒼術(shù)酮的靶點(diǎn)信息后篩去重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到53 個(gè)關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)；通過(guò)Cytoscape 3.7.2 軟件將蒼術(shù)素、β-桉葉醇、蒼術(shù)酮構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖6。

圖6 “成分-靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Network diagramof component-target

3.3.2 PPI 構(gòu)建與分析 將篩選出的53 個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)，核心靶點(diǎn)繪制的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖7。通過(guò)Cytoscape 3.7.2 拓?fù)涮卣鞣治鯬PI 網(wǎng)絡(luò)圖，核心靶點(diǎn)篩選條件為度中心性和中介中心性參數(shù)均大于中位數(shù)且度值≥3，共得到15 個(gè)靶點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選結(jié)果Tab.4 Results of key targets screening

圖7 PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.7 PPI network

3.3.3 GO 功能富集分析 利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到GO 條目包含BP（生物過(guò)程）、CC（細(xì)胞組成）、MF（分子功能）條目，分別為79、31、40個(gè)，占比52.7%，20.7%，26.7%。設(shè)置P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05，根據(jù)P值由小到大排序，取前10 條通路，可視化分析得到圖8。生物過(guò)程主要涉及細(xì)胞對(duì)雌激素刺激的反應(yīng)、乳腺腺泡發(fā)育、調(diào)節(jié)平滑肌收縮、疼痛反應(yīng)、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、細(xì)胞對(duì)鉀離子的反應(yīng)等；細(xì)胞組成主要涉及軸膜、胞外區(qū)、薄膜、心臟肌原纖維、神經(jīng)肌肉接頭、突觸、樹(shù)突骨架、高爾基體膜等；分子功能主要涉及氧化還原酶活力、生長(zhǎng)因子蛋白結(jié)合、肌鈣蛋白I 結(jié)合、小蛋白激活酶結(jié)合等。

圖8 GO 功能分析Fig.8 GO function analysis

3.3.4 KEGG 通路富集分析 共得到12 條信號(hào)通路，結(jié)果見(jiàn)表5，可視化分析結(jié)果見(jiàn)圖9。

表5 靶點(diǎn)富集分析Tab.5 Enrichment analysis of target

圖9 KEGG 分析Fig.9 KEGG analysis

3.3.5 “成分-靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 根據(jù)Cytoscape3.7.2 軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，以連接度為參考，預(yù)測(cè)蒼術(shù)素、β-桉葉醇、蒼術(shù)酮是北蒼術(shù)藥材發(fā)揮功效的重要基礎(chǔ)。北蒼術(shù)發(fā)揮利尿、抗炎以及抗癌等藥理活性與這些成分關(guān)系密切［8］。

由圖10 可知，連接度較高的靶點(diǎn)PSEN2、APH1B、PSEN1 等在癌癥的發(fā)生、發(fā)展，體內(nèi)正常代謝以及阿爾茲海默病中起重要作用，體現(xiàn)在激素調(diào)節(jié)、腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化、侵襲、基因變異等生物過(guò)程中［9-13］，因此分析其可能是北蒼術(shù)藥材發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其 中，PSEN2、APH1B、PSEN1、APH1A、NCSTN、PSENEN 等是引起阿爾茲海默氏病關(guān)鍵因素γ-分泌酶的組件蛋白［14］。細(xì)胞色素P450 氧化代謝酶系是參與化療藥物代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶，與多數(shù)抗腫瘤藥物的生物轉(zhuǎn)化、代謝消除密切相關(guān)［15］。組織蛋白酶CTSB、CTSL、CTSS 等是溶酶體蛋白中激活自噬所需最多的蛋白酶，主要與應(yīng)激條件下周期長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)大的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的降解有關(guān)［16］。連接度較高的甾體激素生物合成通路、凋亡通路、溶酶體通路、阿爾茨海默病通路、Notch 信號(hào)通路是北蒼術(shù)發(fā)揮治療阿爾茲海默病及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤癌變、心腦血管疾病的關(guān)鍵調(diào)控通路［17-20］?！俺煞?靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，說(shuō)明北蒼術(shù)符合中藥多成分、多靶點(diǎn)和多途徑協(xié)同作用的典型特點(diǎn)。

圖10 “成分-靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.10 Network diagram of composition-target-pathway

4 討論

本研究首先對(duì)北蒼術(shù)化學(xué)成分進(jìn)行表征，通過(guò)HPLC 分析建立北蒼術(shù)藥材的指紋圖譜，相似度評(píng)價(jià)良好，18 個(gè)共有峰得到確認(rèn)，并對(duì)其中4 個(gè)色譜峰（綠原酸、β-桉葉醇、蒼術(shù)素、蒼術(shù)酮）進(jìn)行指認(rèn)；方法學(xué)考察精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好（RSD＜3.0%），表明此方法準(zhǔn)確可靠，可作為北蒼術(shù)藥材定性鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)的依據(jù)。

在22 批藥材指紋圖譜相似度分析中，18 批樣品相似度高于0.90。PCA 結(jié)果分析，β-桉葉醇、蒼術(shù)酮落在第1 主成分，蒼術(shù)素落在第2 主成分，綠原酸落在第3 主成分，說(shuō)明β-桉葉醇、蒼術(shù)素、蒼術(shù)酮在決定不同批次間北蒼術(shù)藥材質(zhì)量差異上作用重大。其中，綠原酸不是蒼術(shù)屬植物的代表性成分［21］。因此，指紋圖譜方法、化學(xué)模式識(shí)別與成分藥效相結(jié)合，可以確定北蒼術(shù)藥材含量測(cè)定指標(biāo)為蒼術(shù)素、β-桉葉醇、蒼術(shù)酮，指標(biāo)選擇更合理，能更科學(xué)、全面地反映藥材質(zhì)量，可作為北蒼術(shù)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升的重要依據(jù)。

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)北蒼術(shù)中蒼術(shù)素、β-桉葉醇、蒼術(shù)酮進(jìn)行藥效成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其主要作用于PSEN2、APH1B、PSEN1、UGT2B7、SLC6A4、CTSB 等15 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過(guò)甾體激素生物合成信號(hào)通路、Notch 信號(hào)通路、溶酶體通路、凋亡等信號(hào)通路發(fā)揮抑炎、抑菌、抗病毒等作用。“成分-靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建為預(yù)測(cè)北蒼術(shù)的功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)提供依據(jù)，同時(shí)為闡釋北蒼術(shù)發(fā)揮燥濕健脾、抗菌消炎等傳統(tǒng)功效的作用機(jī)制提供思路［22］。蒼術(shù)素是通過(guò)PKA-SERCA2a 通路發(fā)揮增加心肌細(xì)胞鈣釋放的幅值正性肌力作用，與KEGG富集得到的心肌收縮通路具有一定的相關(guān)性［23］；蒼術(shù)酮具有一定的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)，主要體現(xiàn)在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的抑制和減少肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增長(zhǎng)，通過(guò)凋亡途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡［24］；β-桉葉醇可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的作用［25］。

綜上所述，蒼術(shù)素、β-桉葉醇、蒼術(shù)酮可作為北蒼術(shù)的功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)，后期可利用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證分析。