康 莉，李 波，王曉棟，吳 莉，劉友平，魏 嵋*

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000； 2.西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000）

原發(fā)性肝癌是指起源于肝細胞或肝內(nèi)膽管上皮細胞的惡性腫瘤，包括肝細胞癌、肝內(nèi)膽管癌和肝細胞癌-肝內(nèi)膽管癌混合型3 種不同的病理類型。目前臨床治療原發(fā)性肝癌，早期主要以手術(shù)治療為主，中晚期采用微創(chuàng)治療、全身化療和分子靶向治療等，但依然面臨術(shù)后復(fù)發(fā)率高，放、化療和分子靶向治療帶來的副作用問題［1-2］。而中醫(yī)臨床根據(jù)肝癌本虛標(biāo)實、虛實夾雜的特點，以扶正祛邪，標(biāo)本兼治，恢復(fù)肝主疏泄之功能為治療原則，使氣血運行流暢，濕熱瘀毒之邪外排，從而緩解病情［3］。隨著我國肝癌日均診治費用逐年增長，在充分發(fā)揮中醫(yī)藥防治肝癌優(yōu)勢的基礎(chǔ)上，尋找到更具療效、副作用小、經(jīng)濟實惠，且能在有效控制病灶復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移情況下提高患者生存質(zhì)量的治療方法，變得尤為重要。

芪樓丸是全國名老中醫(yī)孫同郊教授治療肝癌的經(jīng)驗方，該方主要藥材有十余種，其中包括黃芪、重樓、女貞子、墨旱蓮、莪術(shù)、白術(shù)等，具有益氣養(yǎng)陰、扶助正氣、祛邪解毒抗癌等功效。本課題組前期臨床觀察及動物實驗證實芪樓丸能夠有效提高大多數(shù)原發(fā)性肝癌患者免疫功能，延長生存期，改善生活質(zhì)量［4-5］。本實驗將以肝癌細胞為對象進行實驗，深入探討芪樓丸治療肝癌的相關(guān)分子機制，為芪樓丸的開發(fā)奠定良好的實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥物 芪樓丸由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，所含藥材經(jīng)本院制劑室蒲清榮主任中藥師鑒定為正品，將其制作成1.76 g／mL 的浸膏。

1.2 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量250～375 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）2018-17，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，實驗動物使用許可證號SYXK（川）2018-065，實驗經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會審批通過（編號SWMU 20210387）。

1.3 細胞 人肝癌HepG2 細胞株，由賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司提供，使用含10%FBS、1% 青-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按1∶2 比例傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.4 試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基（以色列Biological Industries 公司，批號2123159）；胎牛血清（德國PAN-Biotech 公司，貨號ST30-3301）；Annexin-V／FITC 凋亡試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20210531）；CCK-8 試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所，貨號CK04）；RT 試劑盒、PCR 反應(yīng)液［東洋紡（上海）生物科技有限公司，貨號FSQ-201、QPK-201］；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司，貨號PP1001）；GAPDH 內(nèi)參抗體（美國Santa Cruz 公司，貨號SC-32233）；JAK2、STAT3、STAT5、p-JAK2、p-STAT3 一抗及羊抗兔IgG-HRP 二抗（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號22v9316、15x8824、88j7342、75d7669、74m1478、56j9958）；ELISA 試劑盒（泉州市睿信生物科技有限公司，批號06／2021）。

1.5 儀器 生物安全柜（濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（上海天棋制藥機械有限公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；全波長酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）；流式細胞儀（美國BD 公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）；電泳儀及附件（北京凱元信瑞儀器有限公司）。

2 方法

2.1 含藥血清制備 大鼠隨機分為對照組（生理鹽水10 mL／kg）和芪樓丸低、中、高劑量組（6.75、13.5、27 g／kg），每組10 只，每天早晚各給藥1 次，連續(xù)灌胃5 d，于末次給藥后1 h，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg／kg）進行麻醉，腹主動脈取血，室溫下靜置2 h，離心后取上清液，于56 ℃水浴滅活30 min，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得含藥血清，于－80 ℃冰箱中保存待用。

2.2 CCK8 法檢測細胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期HepG2 細胞，調(diào)整密度為5×104／mL，接種于96孔板，每孔100 μL，分為空白組（無細胞，僅100% DMEM 培養(yǎng)液）、對照組（含細胞，100%DMEM 培養(yǎng)液）和芪樓丸低、中、高劑量組（含細胞，90% DMEM 培養(yǎng)液＋10% 各組含藥血清），每組6 個復(fù)孔，待細胞貼壁后，加入對應(yīng)培養(yǎng)液，分別孵育24、48、72 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入90 μL 完全培養(yǎng)基、10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀檢測其在450 nm 波長處光密度值，計算細胞增殖抑制率。

2.3 Annexin-V／PI 雙染法檢測細胞凋亡情況 取對數(shù)生長期HepG2 細胞，調(diào)整密度為5×104／mL，接種于6 孔板，每孔2 mL，分為對照組（100%DMEM 培養(yǎng)液）和芪樓丸低、中、高劑量組（90%DMEM 培養(yǎng)液＋10%各組含藥血清），每組3個復(fù)孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，分別加入對應(yīng)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，離心收集細胞，重懸后用冷PBS 溶液進行洗滌，去除上清液，向其中加入1×Binding Buffer 懸浮細胞，取出1×105個細胞，分別向其中加入5 μL Annexin V／FITC 和5 μL PI／PE 溶液，暗室中避光振蕩15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.4 RT-qPCR 法檢測細胞Bax、Bcl-2 mRNA 表達 取對數(shù)生長期HepG2 細胞，于6 cm 培養(yǎng)皿中（5×107個／皿）培養(yǎng)貼壁后，分為對照組（無細胞，僅100%DMEM 培養(yǎng)液）和芪樓丸低、中、高劑量組（90%DMEM 培養(yǎng)液＋10%各組含藥血清），每組3 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后提取各組細胞總RNA，按照RT-qPCR 試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進行擴增反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參，通過2－ΔΔCT法計算各目的基因mRNA 相對表達。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.5 ELISA 法檢測細胞Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9 水平 取對數(shù)生長期HepG2 細胞，接種于24 孔板，每孔1×105個，分為對照組（100%DMEM 培養(yǎng)液）和芪樓丸低、中、高劑量組（90% DMEM培養(yǎng)液＋10%各組含藥血清），每組6 個復(fù)孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后分別加入對應(yīng)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，離心收集細胞，重懸后用冷PBS 洗滌，1 200 r／min 離心5 min，棄上清，沉淀加裂解液裂解30 min，每5 min 振蕩1 次，4 ℃、12 000 r／min離心15 min，取上清，－20 ℃保存?zhèn)溆?。按照ELISA 試劑盒說明書檢測細胞裂解液中Bax、Bcl-2、caspase-3 和caspase-9 水平。

2.6 Western blot 檢測細胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、STAT5 蛋白表達 取對數(shù)生長期HepG2細胞，接種于6 孔板，分為對照組（100% DMEM培養(yǎng)液）和芪樓丸低、中、高劑量組（90%DMEM培養(yǎng)液＋10%各組含藥血清），每組3 個復(fù)孔，待各孔細胞融合度達80%～90%時分別加入對應(yīng)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，離心收集細胞，PBS 洗滌，加入RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r／min離心15 min，取上清液，BCA 法測定蛋白濃度，蛋白變性后分裝置于－80 ℃冰箱保存。蛋白樣本進行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，TBST 溶液洗膜，加入一抗JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、STAT5、GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST 溶液洗滌，加入二抗（1∶4 000），室溫孵育1 h，TBST 溶液洗滌，加入ECL超敏發(fā)光液，用凝膠成像儀對條帶進行顯影，以GAPDH 為內(nèi)參，對目的蛋白相對表達量進行分析。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 24.0 軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 芪樓丸含藥血清對HepG2 細胞增殖抑制率的影響 如圖1 所示，與對照組比較，隨藥物劑量增加及處理時間的延長，HepG2 細胞增殖抑制率逐漸升高（P＜0.01），表明芪樓丸含藥血清能抑制HepG2 細胞增殖，且呈劑量和時間依賴性。

圖1 芪樓丸含藥血清對HepG2 細胞增殖的影響（±s， n＝6）Fig.1 Effects of Qilou Pills-containing serum on HepG2 cell proliferation（±s， n＝6）

3.2 芪樓丸含藥血清對HepG2 細胞凋亡的影響如圖2～3 所示，與對照組比較，芪樓丸中、高劑量組細胞凋亡率升高（P＜0.01），并呈劑量依賴性。由此可見，芪樓丸含藥血清可促進HepG2 細胞的凋亡。

圖2 各組細胞凋亡情況Fig.2 Cell apoptosis in each group

3.3 芪樓丸含藥血清對HepG2 細胞Bcl-2、BaxmRNA 表達的影響 如圖4 所示，與對照組比較，芪樓丸中、高劑量組細胞BaxmRNA 表達升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表達降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性。

圖3 芪樓丸含藥血清對HepG2 細胞凋亡的影響（±s，n＝3）Fig.3 Effects of Qilou Pills-containing serum onapoptosis of HepG2 cells（±s， n＝3）

圖4 芪樓丸含藥血清對HepG2 細胞Bcl-2、 Bax mRNA 表達的影響（±s， n＝3）Fig.4 Effects of Qilou Pills-containing serum on the mRNA expressions of Bcl-2 and Bax in HepG2 cells（±s， n＝3）

3.4 芪樓丸含藥血清對HepG2 細胞凋亡因子的影響 如圖5 所示，與對照組比較，芪樓丸各劑量組細胞caspase-3、caspase-9、Bax 水平均升高（P＜0.01），Bcl-2 水平均降低（P＜0.01）。

圖5 芪樓丸含藥血清對HepG2 細胞caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2 水平的影響（±s， n＝6）Fig.5 Effects of Qilou Pills-containing serum on the levels of caspase-3，caspase-9，Bax and Bcl-2 in HepG2 cells（±s， n＝6）

3.5 芪樓丸含藥血清對HepG2 細胞JAK／STAT 信號通路關(guān)鍵蛋白表達的影響 如表2、圖6 所示，與對照組比較，芪樓丸各劑量組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、STAT5 蛋白表達隨藥物濃度升高而下降（P＜0.01）。

圖6 各組細胞JAK2、STAT3、STAT5、p-JAK2、p-STAT3 蛋白條帶圖Fig.6 Protein bands of JAK2，STAT3，STAT5，p-JAK2 and p-STAT3 in each group of cells

表2 芪樓丸含藥血清對HepG2 細胞JAK2、STAT3、STAT5、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達的影響（±s， n＝3）Tab.2 Effects of Qilou Pills-containing serum on the protein expressions of JAK2，STAT3，STAT5，p-JAK2 and p-STAT3 in HepG2 cells（±s， n＝3）

表2 芪樓丸含藥血清對HepG2 細胞JAK2、STAT3、STAT5、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達的影響（±s， n＝3）Tab.2 Effects of Qilou Pills-containing serum on the protein expressions of JAK2，STAT3，STAT5，p-JAK2 and p-STAT3 in HepG2 cells（±s， n＝3）

注：與對照組比較，**P＜0.01。

4 討論

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，涉及到多種因素、多個階段、多個環(huán)節(jié)，與機體本身和外部環(huán)境均有一定關(guān)系［6］。目前已知腫瘤細胞的失控性快速生長與細胞的凋亡下調(diào)有關(guān)。JAK／STAT信號通路是調(diào)控細胞增殖與凋亡的重要通路，尤其在腫瘤，如肝癌、結(jié)腸癌等實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用［7］。細胞因子和表面的受體相結(jié)合，從而使受體二聚化，促進和受體關(guān)聯(lián)的JAK 家族發(fā)生聚集反應(yīng)，刺激JAK 激酶的激活。當(dāng)JAK 激酶激活后，會使受體中的STAT 蛋白產(chǎn)生磷酸化反應(yīng)，從而使STAT 蛋白被激活后離開受體進入細胞核中，在細胞核中對基因的調(diào)控產(chǎn)生影響。因此，JAK 激酶和STAT 蛋白的表達會對細胞增殖、凋亡等活動產(chǎn)生影響［8］。已有研究證實，人肝癌組織中JAK2、STAT3、STAT5 活化水平明顯高于癌旁組織，其中磷酸化STAT3（p-STAT3）水平越高，預(yù)后越差［9-11］，其機制主要為STAT3 信號激活后可誘導(dǎo)下游抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1 等表達增加，促凋亡蛋白Bax、Bak 和凋亡效應(yīng)因子caspase-3、caspase-9 表達降低，從而對細胞增殖產(chǎn)生影響，并抑制細胞凋亡來傳遞致癌信號［12-13］。大量研究證明，部分中藥單體可調(diào)控JAK2、STAT3、STAT5蛋白表達來抑制肝癌細胞增殖，促進肝癌細胞凋亡［14-15］。但目前關(guān)于中藥復(fù)方基于JAK／STAT 信號通路作用于原發(fā)性肝癌的相關(guān)報道較為少見，仍需進一步探究。

芪樓丸由黃芪、重樓、女貞子、墨旱蓮、莪術(shù)、白術(shù)等十余味中草藥組成，是孫同郊教授研發(fā)治療中晚期肝癌的經(jīng)驗方。孫同郊教授認為當(dāng)原發(fā)性肝癌患者的病程到達中晚期時，其病理表現(xiàn)主要為“虛實夾雜、本虛標(biāo)實”，其中本虛指的是氣虛和陰虛，標(biāo)實指的是淤血和熱毒膠結(jié)，而淤血存在于肝癌發(fā)生發(fā)展的整個過程。該方黃芪為補氣類代表藥，其含有的活性成分能夠調(diào)節(jié)免疫功能，提高細胞因子活性，從而起到增強免疫的作用［16］；重樓可活血化瘀、清熱解毒，其有效成分重樓皂苷Ⅰ可抑制肝癌細胞增殖和遷移［17］，此二藥并用為君，可針對肝癌病機中虛實兩端，發(fā)揮攻補兼施作用。女貞子、墨旱蓮入肝腎經(jīng)，二者協(xié)同作用，可通過多靶點、多通路對肝癌產(chǎn)生治療作用［18］；莪術(shù)苦泄辛散溫通，其含有姜黃素類、莪術(shù)二酮等單體成分具有很好的抗炎、抗腫瘤等藥理作用［19］，此三味為臣藥，共湊活血化瘀，清熱解毒之功。佐以白術(shù)等藥材，有助于增強“脾氣”，起到調(diào)理腸胃、提高免疫力等功能［20］?？v觀全方，扶正與祛邪并重，強調(diào)“留得一分正氣，便存得一分生機”。

本實驗表明，芪樓丸能降低Bcl-2 mRNA 表達和Bcl-2 水平，升高BaxmRNA 表達和 Bax、caspase-3、caspase-9 水平，且有效抑制了JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、STAT5 蛋白表達，提示芪樓丸能抑制人肝癌HepG2 細胞增殖，促進其凋亡，其機制可能與通過調(diào)節(jié)JAK／STAT 信號通路有關(guān)。