林子棟，席作武，劉洪波

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南省中醫(yī)院肛腸科，河南 鄭州 450002；3.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 南陽(yáng) 473061）

潰瘍性結(jié)腸炎是臨床中常見(jiàn)的一種疑難腸病，以持續(xù)性和彌漫性炎癥為主要特征，臨床表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、里急后重等，其病灶局限于結(jié)腸黏膜并向直腸近端延伸，其患病率呈不斷上升趨勢(shì)［1］。潰瘍性結(jié)腸炎的治療周期長(zhǎng)、成本高，且纏綿難愈，增加了患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋找安全有效的潰瘍性結(jié)腸炎治療藥物顯得尤為必要［2］。近年來(lái)，中藥以其多成分和多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，在該病治療中發(fā)揮重要作用，較西醫(yī)有療效佳、復(fù)發(fā)率低和副作用少等優(yōu)點(diǎn)。

氧化損傷和炎癥反應(yīng)是潰瘍性結(jié)腸炎的主要特征。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（sirtuin1，SIRT1）作為一種組蛋白去乙?；?，在機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激和抑制炎癥反應(yīng)中起重要作用［3］。研究表明在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)SIRT1 表達(dá)明顯降低［4-5］；SIRT1表達(dá)上調(diào)可以減弱潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥反應(yīng)［6］。復(fù)方苦參湯是河南省中醫(yī)院肛腸科臨床常用的中醫(yī)外治方，是國(guó)家級(jí)知名專家席作武教授臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎的經(jīng)驗(yàn)方，效果顯著，然而復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用是否與SIRT1信號(hào)通路有關(guān)，目前并不清楚。本研究采用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，并基于SIRT1 通路進(jìn)一步明確復(fù)方苦參湯在治療潰瘍性結(jié)腸炎過(guò)程中潛在的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)小鼠70 只，雌雄各半，6～8 周齡，體質(zhì)量（20±3）g，購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（豫）2019-022，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK（豫）2019-022。小鼠在12 h／12 h 黑暗／光照循環(huán)，相對(duì)濕度（55±5）%，溫度（23±2）℃的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行飼養(yǎng)，自由采食和飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均按照《國(guó)立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南》進(jìn)行，并經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)PZ-HNSZYY-2021-007）。

1.2 試劑與藥物 復(fù)方苦參湯（大黃30 g、黃連30 g、黃芩30 g、苦參30 g、地榆30 g、紫花地丁30 g、蒲公英30 g、大青葉30 g、馬齒莧30 g、金銀花30 g、野菊花30 g、槐米30 g、白鮮皮30 g、黃柏30 g、芒硝30 g）由河南省中醫(yī)院藥劑科提供，經(jīng)河南省中醫(yī)院焦偉杰副主任藥師鑒定為正品。復(fù)方苦參湯藥材加入10 倍量純水浸泡2 h，煎煮30 min，過(guò)濾后同法再次煎煮30 min，合并2 次濾液并濃縮至生藥量0.6 g／mL，置于4 ℃冷藏備用。DSS（批號(hào)Q9358）購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司；SIRT1 抑制劑EX527（批號(hào)HY-15452）購(gòu)自美國(guó)Med Chem Express 公司；多聚甲醛組織固定液（批號(hào)21200490）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；小鼠腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-alpha，TNFα）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒（批號(hào) ml002859、ml064292、ml037361、ml037361）購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)S0131S、P0012S）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）探針（批號(hào)HR9069）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；SIRT1、乙?；艘蜃应蔅（Acetylated nuclear factor κB，Acetyl NF-κB）、錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，SOD2）、β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（批號(hào) 8469S、12629S、13141T、4970S）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）抗體（批號(hào)AS09501a）購(gòu)自美國(guó)Agrisera 公司。

1.3 儀器 RM2245 石蠟切片機(jī)、CM1850 冰凍切片機(jī)（德國(guó)Lecia 公司）；Shandon Citadel 2000 全自動(dòng)脫水機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；TK-218 烘干機(jī)（湖北泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司）；5427R 低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；SilverUVIpro 凝膠數(shù)字成像分析儀（英國(guó)UVItec 公司）；BX53 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；Mini-PROTEAN 蛋白質(zhì)電泳與轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）；Spectra MaxM3 酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices 公司）；Pannoramic 250 切片掃描系統(tǒng)（匈牙利3D HISTECH 公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 70 只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組，模型組，復(fù)方苦參湯低、中、高劑量組，柳氮磺吡啶組，復(fù)方苦參湯＋EX527 組，每組10 只，對(duì)照組給予正常飲用水，其余各組小鼠給予含3% DSS 的飲用水，每隔1 d 更換1 次，自由飲水7 d 以制備潰瘍性結(jié)腸炎模型，出現(xiàn)便血和體質(zhì)量降低則提示模型復(fù)制成功。從造模第1 天開(kāi)始，復(fù)方苦參湯組小鼠分別給予復(fù)方苦參湯低、中、高劑量（3、6、12 g／kg）灌腸；柳氮磺吡啶組灌胃給予300 mg／kg 柳氮磺吡啶；復(fù)方苦參湯＋EX527 組小鼠在給予12 g／kg 復(fù)方苦參湯灌腸的同時(shí)腹腔注射5 mg／kg EX527；對(duì)照組和模型組給予等體積0.9%氯化鈉灌腸，每天1 次，連續(xù)7 d。

2.2 小鼠一般狀態(tài)評(píng)價(jià)與疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分 每天給藥后30 min 觀察并記錄各組小鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度、大便性狀、體質(zhì)量變化、便血情況及攝食飲水量，并進(jìn)行DAI 評(píng)分。

2.3 樣本采集與處理 造模結(jié)束后，各組小鼠禁食12 h，次日眼球取血后采取頸椎脫臼法處死，剝離小鼠結(jié)腸組織，使用標(biāo)尺測(cè)量各組小鼠結(jié)腸組織的長(zhǎng)度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。生理鹽水預(yù)冷后清除小鼠腸內(nèi)糞便，取部分結(jié)腸組織固定于4%多聚甲醛中，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色處理；其余結(jié)腸組織凍存于－80 ℃冰箱備用。

2.4 免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織中SIRT1 表達(dá) 取各組小鼠結(jié)腸組織石蠟切片，脫蠟及水化后高壓熱修復(fù)抗原，加3% H2O2于37 ℃孵育10 min，常規(guī)洗滌吸干后加入血清封閉，滴加SIRT1 抗體（1∶100），4 ℃孵育過(guò)夜，常規(guī)洗滌后滴加二抗，37 ℃孵育30 min，常規(guī)洗滌吸干后滴加DAB 工作液顯色，光學(xué)顯微鏡下拍照。隨機(jī)觀察每張切片中5 個(gè)不同視野，分別按照陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0 分表示為陰性，1 分表示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)不超過(guò)10%，2分表示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為11%～50%，3 分表示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為51%～75%，4 分表示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)超過(guò)75%；染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0、1、2 分分別對(duì)應(yīng)無(wú)色、淡黃色和棕黃色，最終根據(jù)二者結(jié)果計(jì)算SIRT1 的表達(dá)積分。

2.5 結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)觀察與評(píng)價(jià) 將固定的結(jié)腸組織常規(guī)脫水處理后采用二甲苯透明化，石蠟包埋，切片（5 μm），烤片脫蠟后常規(guī)HE 染色，封片，使用雙盲法在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄各組小鼠結(jié)腸組織的病理形態(tài)學(xué)情況，采集圖片。結(jié)腸損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)有潰瘍（0、1、2 分依次代表無(wú)潰瘍、潰瘍小于3 mm、潰瘍大于3 mm）、炎癥（0、1、2 分依次代表無(wú)、輕度、中度）、病變的深度（0、1、2、3 分依次代表無(wú)、黏膜下層、肌層、漿膜層）。

2.6 ELISA 法檢測(cè)結(jié)腸組織中炎性因子水平 分別稱取凍存于－80 ℃冰箱的各組小鼠結(jié)腸組織各50 mg，加入預(yù)冷的無(wú)菌PBS，充分勻漿后4 ℃、3 000 r／min 離心15 min，分離得上清液，參照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β 水平和MPO 活性。

2.7 DHE 染色法及比色法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織氧化損傷情況 將分離的結(jié)腸組織取部分制作冰凍切片（厚度40 μm），按照DHE 熒光探針檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色（濃度5 μmol／L）及清洗，熒光顯微鏡下觀察切片的染色情況，記錄熒光強(qiáng)度并計(jì)算平均值作為ROS 水平。依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用比色法測(cè)定小鼠結(jié)腸組織上清液中MDA 水平。

2.8 Western blot 法檢測(cè)結(jié)腸組織中Acetyl-NF-κB、CAT、SOD2 蛋白表達(dá) 取小鼠結(jié)腸組織研磨后加入RIPA 裂解液在冰上裂解，反復(fù)吹打使其松散，冰浴30 min 后4 ℃、12 000 r／min 離心15 min，提取蛋白上清液，按比例加入上樣緩沖液后于水浴鍋內(nèi)100 ℃煮沸10 min 進(jìn)行變性，BCA 蛋白定量法檢測(cè)其蛋白濃度。蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，用含有5% 脫脂奶粉的TBST（封閉液）于4 ℃下封閉2 h，加入一抗Acetyl-NF-κB（1∶1 000）、CAT（1∶1 000）、SOD2（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 充分洗滌3 次，加入二抗室溫孵育1 h，TBST 充分洗滌3次，加入ECL 顯色液于PVDF 膜上后，在曝光儀中測(cè)定各組蛋白條帶的吸光度，用Image J 軟件分析條帶灰度值，通過(guò)與內(nèi)參β-actin 的比值來(lái)表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析配合Tukey 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠一般狀態(tài)和DAI 評(píng)分的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠有7只在第2 天出現(xiàn)糞便隱血呈陽(yáng)性，在實(shí)驗(yàn)第4 天則全呈現(xiàn)陽(yáng)性，與此同時(shí)小鼠會(huì)伴有精神狀態(tài)萎靡、毛發(fā)凌亂缺乏光澤、大便稀溏以及體質(zhì)量減輕，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，這些癥狀表現(xiàn)得更加明顯，甚至?xí)殡S有血便的出現(xiàn)；柳氮磺吡啶組和復(fù)方苦參湯各劑量組小鼠上述癥狀得到不同程度的緩解；復(fù)方苦參湯＋EX527 組小鼠的一般狀態(tài)并未得到有效緩解。

如表1 所示，與對(duì)照組比較，隨著DSS 處理時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組小鼠DAI 評(píng)分升高（P＜0.01）；與模型組比較，復(fù)方苦參湯各劑量組和柳氮磺吡啶組均減弱了DSS 引起的DAI 評(píng)分升高（P＜0.05，P＜0.01）；與同時(shí)間點(diǎn)復(fù)方苦參湯組高劑量組比較，復(fù)方苦參湯＋EX527 處理組小鼠DAI評(píng)分升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠DAI 評(píng)分的影響（分，±s， n＝10）Tab.1 Effects of Compound Sophorae Decoction on DAI score of UC mice（score，±s， n＝10）

表1 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠DAI 評(píng)分的影響（分，±s， n＝10）Tab.1 Effects of Compound Sophorae Decoction on DAI score of UC mice（score，±s， n＝10）

注：與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，**P＜0.01；與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與同時(shí)間點(diǎn)復(fù)方苦參湯高劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.2 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度縮短（P＜0.01）；與模型組比較，柳氮磺吡啶組和復(fù)方苦參湯各劑量組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度增長(zhǎng)（P＜0.05，P＜0.01）；與復(fù)方苦參湯高劑量組比較，復(fù)方苦參湯＋EX527 組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度縮短（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響（±s， n＝10）Tab.2 Effects of Compound Sophorae Decoction on colonic length of UC mice（±s， n＝10）

表2 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響（±s， n＝10）Tab.2 Effects of Compound Sophorae Decoction on colonic length of UC mice（±s， n＝10）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與復(fù)方苦參湯高劑量組比較，△△P＜0.01。

3.3 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織SIRT1 表達(dá)的影響 SIRT1 的陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞核上。與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中SIRT1 表達(dá)減少，表達(dá)評(píng)分降低（P＜0.01）；與模型組比較，柳氮磺吡啶組和復(fù)方苦參湯各劑量組小鼠結(jié)腸組織SIRT1 表達(dá)增加，表達(dá)評(píng)分升高（P＜0.05，P＜0.01）；與復(fù)方苦參湯高劑量組比較，復(fù)方苦參湯＋EX527 組小鼠結(jié)腸SIRT1 表達(dá)減少，表達(dá)評(píng)分降低（P＜0.01），見(jiàn)圖1、表3。

表3 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織SIRT1 表達(dá)評(píng)分的影響（分，±s， n＝10）Tab.3 Effects of Compound Sophorae Decoction on SIRT1 expression scores of UC mice（score，±s， n ＝10）

表3 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織SIRT1 表達(dá)評(píng)分的影響（分，±s， n＝10）Tab.3 Effects of Compound Sophorae Decoction on SIRT1 expression scores of UC mice（score，±s， n ＝10）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與復(fù)方苦參湯高劑量組比較，△△P＜0.01。

圖1 各組小鼠SIRT1 表達(dá)情況（×400）Fig.1 Expression of SIRT1 in mice in each group（×400）

3.4 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)的影響 如圖2 所示，對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織黏膜光滑完整，排列整齊，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)；模型組小鼠結(jié)腸組織黏膜上皮結(jié)構(gòu)遭到破壞，上皮細(xì)胞出現(xiàn)破損并可見(jiàn)炎性浸潤(rùn)；柳氮磺吡啶和復(fù)方苦參湯各劑量組小鼠結(jié)腸組織黏膜上皮細(xì)胞保持相對(duì)完整，炎性浸潤(rùn)明顯變少；EX527 處理則減弱了復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織黏膜組織的保護(hù)作用。此外，如表4 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸病理學(xué)評(píng)分升高（P＜0.01）；與模型組比較，復(fù)方苦參湯各劑量組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分降低（P＜0.05，P＜0.01）；與復(fù)方苦參湯高劑量組比較，復(fù)方苦參湯＋EX527 組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分升高（P＜0.01）。

表4 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分的影響（分，±s， n＝10）Tab.4 Effects of Compound Sophorae Decoction on histopathological scores of UC mice（score，±s， n＝10）

表4 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分的影響（分，±s， n＝10）Tab.4 Effects of Compound Sophorae Decoction on histopathological scores of UC mice（score，±s， n＝10）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與復(fù)方苦參湯高劑量組比較，△△P＜0.01。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化（×400）Fig.2 Histomorphological changes of colon in mice of each group（×400）

3.5 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織炎癥因子水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平 及MPO 活性升高（P＜0.01）；與模型組比較，柳氮磺吡啶組和復(fù)方苦參湯各劑量組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-6、IL-1β 水平及MPO 活性降低（P＜0.05，P＜0.01）；與復(fù)方苦參湯高劑量組比較，復(fù)方苦參湯＋EX527 組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-6、IL-1β 水平及MPO 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表5。

表5 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠炎性因子水平的影響（±s， n＝10）Tab.5 Effects of Compound Sophorae Decoction on inflammatory factor levels of UC mice（±s， n＝10）

表5 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠炎性因子水平的影響（±s， n＝10）Tab.5 Effects of Compound Sophorae Decoction on inflammatory factor levels of UC mice（±s， n＝10）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與復(fù)方苦參湯高劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.6 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中ROS、MDA 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，柳氮磺吡啶和復(fù)方苦參湯各劑量組小鼠結(jié)腸組織ROS、MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；與復(fù)方苦參湯高劑量組比較，復(fù)方苦參湯＋EX527 組小鼠結(jié)腸組織ROS、MDA 水平升高（P＜0.01），見(jiàn)圖3、表6。

表6 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（±s， n＝10）Tab.6 Effects of Compound Sophorae Decoction on colon oxidative stress indices of UC mice（±s， n＝10）

表6 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（±s， n＝10）Tab.6 Effects of Compound Sophorae Decoction on colon oxidative stress indices of UC mice（±s， n＝10）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與復(fù)方苦參湯高劑量組比較，△△P＜0.01。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織ROS 水平（×400）Fig.3 ROS levels in mouse colon of each group（×400）

3.7 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織Acetyl NF-κB、SOD2、CAT 蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織SOD2、CAT 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），Acetyl NF-κB 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，柳氮磺吡啶組和復(fù)方苦參湯各劑量組小鼠結(jié)腸組織SOD2、CAT 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），Acetyl NF-κB 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）；與復(fù)方苦參湯高劑量組比較，復(fù)方苦參湯＋EX527 組小鼠結(jié)腸組織SOD2、CAT 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），Acetyl NF-κB 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），見(jiàn)圖4、表7。

表7 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織Acetyl NF-κB、SOD2、CAT 蛋白表達(dá)的影響（±s， n＝10）Tab.7 Effects of Compound Sophorae Decoction on the colon protein expressions of Acetyl NF-κB，SOD2 and CAT of UC mice（±s， n＝10）

表7 復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織Acetyl NF-κB、SOD2、CAT 蛋白表達(dá)的影響（±s， n＝10）Tab.7 Effects of Compound Sophorae Decoction on the colon protein expressions of Acetyl NF-κB，SOD2 and CAT of UC mice（±s， n＝10）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與復(fù)方苦參湯高劑量組比較，△△P＜0.01。

圖4 各組小鼠結(jié)腸組織Acetyl NF-κB、SOD2、CAT 蛋白條帶圖Fig.4 Bands of colon Acetyl NF-κB，SOD2 and CAT proteins of mice in each group

4 討論

潰瘍性結(jié)腸炎在中醫(yī)學(xué)中歸屬于“痢疾” “久痢” “腸澼” 等。席作武教授認(rèn)為，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生不外乎嗜食肥甘厚味而生濕熱之邪，阻礙胃腸之氣血運(yùn)行，久而及腎，治宜清熱解毒，除濕止痛。復(fù)方苦參湯具有清熱燥濕、涼血解毒、澀腸而止痢的功效［7-11］。本研究結(jié)果表明，復(fù)方苦參湯對(duì)DSS 誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有良好的治療作用。

SIRT1 作為一種去乙酰化酶，包括結(jié)腸在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物組織中均有廣泛表達(dá)，它通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白的乙酰化水平來(lái)對(duì)下游靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控［12］。研究表明，SIRT1 低表達(dá)與潰瘍性結(jié)腸炎引起的結(jié)腸損傷相關(guān)，而上調(diào)SIRT1 表達(dá)則能有效緩解潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的病理?yè)p傷［4］。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中SIRT1 表達(dá)較對(duì)照組降低，復(fù)方苦參湯處理后SIRT1 表達(dá)升高，然而SIRT1 抑制劑EX527 的干預(yù)不僅減弱了復(fù)方苦參湯誘導(dǎo)的SIRT1 表達(dá)升高，而且復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長(zhǎng)度、DAI 指數(shù)、組織病理評(píng)分的保護(hù)作用也被抑制，提示復(fù)方苦參湯通過(guò)調(diào)控SIRT1 信號(hào)對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠起保護(hù)作用。

炎癥因子的過(guò)量表達(dá)與潰瘍性結(jié)腸炎引起的腸道損傷密切相關(guān)。NF-κB 是誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，其轉(zhuǎn)錄活性受到乙?；疦F-κB p65 的調(diào)控，NF-κB p65 在310 位點(diǎn)賴氨酸殘基的乙?；瘯?huì)促進(jìn)p65 亞基入核，誘導(dǎo)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄［13-14］?；罨腟IRT1 會(huì)降低NF-κB p65 的乙?；?，從而抑制炎癥因子水平［15］。為了探究復(fù)方苦參湯是否通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1 信號(hào)來(lái)發(fā)揮抗炎作用，本研究采用SIRT1 抑制劑EX527 來(lái)進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明EX527 緩解了復(fù)方苦參湯對(duì)NF-κB 乙?；降恼{(diào)控作用，其炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平也較復(fù)方苦參湯組升高。此外，MPO 活性的高低可直接反映腸道中炎性損傷的程度［16-17］。本研究結(jié)果表明，EX527 的使用減弱了復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸MPO 活性升高的抑制作用。這些結(jié)果提示，復(fù)方苦參湯通過(guò)激活SIRT1 信號(hào)來(lái)抑制潰瘍性結(jié)腸炎小鼠炎癥損傷。

氧化應(yīng)激作為潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生與發(fā)展的另一重要因素，會(huì)引起ROS 水平升高，抗氧化酶CAT、SOD 活性降低，脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA 水平升高，當(dāng)超過(guò)機(jī)體自由基的清除能力時(shí)就會(huì)對(duì)結(jié)腸組織造成破壞性損傷，同時(shí)會(huì)造成炎癥與組織損傷之間出現(xiàn)惡性循環(huán)［18-20］。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方苦參湯處理降低了潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織ROS、MDA水平，升高了SOD2、CAT 蛋白表達(dá)，而EX527 干預(yù)減弱了復(fù)方苦參湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸氧化損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，復(fù)方苦參湯通過(guò)激活SIRT1 信號(hào)對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎起保護(hù)作用，而活化的SIRT1 減弱了潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織NF-κB 乙?；?，激活SOD2、CAT 蛋白表達(dá)，從而抑制炎性因子水平，減輕氧化損傷。