全德森，柯尊麗，張遠(yuǎn)哲，黎豫川，馬晶鑫，劉林瀟，田維毅，蔡 琨*

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽 550025； 2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，貴州貴陽 550025）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是最常見的慢性肝病，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)椴±硖卣鞯呐R床綜合征，隨著肥胖和2 型糖尿?。═2DM）的流行，其患病率正逐年上升［1-2］，如不及時(shí)治療，極易進(jìn)行性發(fā)展成為肝炎、肝硬化甚至肝癌［3］。研究表明LXRα 是一種對(duì)脂肪和膽固醇代謝具有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)［4］，可通過上調(diào)下游因子SREBP-1c 的表達(dá)來誘導(dǎo)NAFLD 的發(fā)生［5］，并刺激其下游因子FAS 的表達(dá)，進(jìn)一步加劇NAFLD的發(fā)展［6］。根據(jù)NAFLD 的癥狀、病因病機(jī)，中醫(yī)學(xué)將其歸屬于“肝癖” “脅痛” 等范疇，該病機(jī)包含“肝郁脾虛、濕熱內(nèi)蘊(yùn)、痰瘀互結(jié)”［7］。六味降脂湯以《圣濟(jì)總錄》 中古方“茵陳蒿散” 為依據(jù)，經(jīng)歷代醫(yī)家發(fā)揮加味而來，具有清熱利濕、健脾化痰、活血化瘀之功，且前期臨床病例收集研究提示六味降脂湯降脂作用明顯，能夠有效下調(diào)TC、TG及LDL-C 水平，并發(fā)現(xiàn)針對(duì)初期非酒精性脂肪肝患者呈現(xiàn)出較好的臨床療效，能調(diào)節(jié)血脂，保護(hù)肝功能，可顯著改善NAFLD 患者臨床癥狀［8］。但六味降脂湯具體通過何種機(jī)制來治療NAFLD 尚未明確，故本實(shí)驗(yàn)以高脂飼料合并高脂乳劑灌胃建立NAFLD 大鼠模型，探究六味降脂湯是否通過影響LXRα-SREBP-1c-FAS 信號(hào)通路來干預(yù)NAFLD，以期為臨床應(yīng)用提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠42 只，6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0014。大鼠于貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所SPF 級(jí)動(dòng)物房喂飼，實(shí)驗(yàn)操作流程嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的相關(guān)法規(guī)和各項(xiàng)規(guī)定，并通過貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查（審批號(hào)20210003）。

1.2 藥物 六味降脂湯由茵陳、丹參、絞股藍(lán)、生山楂、決明子、荷葉組成，飲片（由貴州同濟(jì)堂中藥飲片有限公司生產(chǎn)，符合2015 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定，生產(chǎn)批號(hào)分別為200628、200617、200707、201126、201015、200806）均購(gòu)自貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院。阿托伐他汀鈣片（北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，10 mg／粒，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990258，生產(chǎn)批號(hào)AA2003033）。

1.3 試劑 總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、超氧化物歧化 酶（SOD）、丙二醛（MDA）、游離脂肪酸（NEFA）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，貨號(hào)A111-1-1、A110-1-1、C009-2-1、C010-2-1、A001-3、A003-1、A042-2-1）；蘇木素-伊紅（HE）、改良油紅O 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)G1120、G1261）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（日本TaKaRa 公司，批號(hào)AL21115A、AL51019A）；二甲苯（天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)202150101）；檸檬酸鹽緩沖液、PBS 緩沖液、DAB試劑盒、二抗（批號(hào)ZLI-9065、ZLI-9062、ZLI-9018、SP9001，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；蘇木素染液（批號(hào)LM10N13，北京百靈威科技有限公司）；LXRα、SREBP-1c 一 抗（批號(hào)NBP2-66938、NB100-2215，美國(guó)Novus 公司）；FAS一抗（批號(hào)GR3210604-1，英國(guó)Abcam 公司）。

1.4 儀器 Verioskam Flash 多功能酶標(biāo)儀、Sorvall ST 40R 高速低溫離心機(jī)、NanoDrop Lite Printer 分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo 公司）；DM4B 型顯微鏡、EG1150C 型石蠟包埋機(jī)、RM2265 型病理切片機(jī)、CM1950 型冰凍切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；CBCL-24 冷凍研磨儀（上海測(cè)博生物科技發(fā)展中心）；CFX 96 TOUCH 型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（美國(guó) Bio-Rad 公司）；BA410 型顯微鏡、BA400Digital 數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及造模 42 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、阿托伐他汀組及六味降脂湯低、中、高劑量組，每組7只。造模期間，空白組給予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組給予高脂飼料合并高脂乳劑喂養(yǎng)（HD001b 高脂飼料購(gòu)自北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)2020 110601；高脂乳劑配方為將30 g 豬油加熱至液體狀態(tài)，依次加入膽固醇5 g、蛋黃粉5 g、豬膽酸鈉1 g、丙硫氧嘧啶0.5 g、葡萄糖5 g、吐溫80 2 mL，最后加蒸鎦水定容至200 mL，即得，現(xiàn)配現(xiàn)用）建立NAFLD 模型，以模型組大鼠生化指標(biāo)水平及肝臟病理切片中出現(xiàn)大小不一的脂滴和氣球樣變?yōu)樵炷３晒?biāo)準(zhǔn)［9］。

2.2 藥物制備及給藥 根據(jù)前期臨床實(shí)踐研究發(fā)現(xiàn)六味降脂湯最優(yōu)配伍比例為茵陳、丹參、絞股藍(lán)、生山楂、決明子、荷葉各20 g。將全方煎煮2次，第一次加9 倍量蒸餾水浸泡30 min 后，武火煮沸，文火煮30 min，過濾取濾液，第二次加7 倍量蒸餾水，武火煮沸，文火煎煮25 min，過濾后取濾液，合并2 次濾液，濃縮至生藥量1.07 g／mL，冷卻后4 ℃冷藏備用。給藥干預(yù)期間，依據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》 中人與大鼠體表面積系數(shù)法換算大鼠用藥劑量，換算出六味降脂湯低、中、高劑量組大鼠每天給藥劑量分別為5.4、10.7、21.4 g／kg；阿托伐他汀組每天給藥劑量為0.9 mg／kg，藥物以蒸餾水配制成所需濃度的藥液；空白組與模型組給予等量蒸餾水灌胃，給藥容量為10 mL／kg。制備NAFLD 模型6 周，給藥干預(yù)2 周，定期記錄體質(zhì)量，調(diào)整給藥體積，給藥與造模同時(shí)進(jìn)行，共計(jì)8 周。

2.3 標(biāo)本采集 8 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以10%水合氯醛（4 mL／kg）麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min后3 500 r／min 離心10 min，吸取血清冷藏備用，用于血清生化指標(biāo)檢測(cè)；迅速剖取大鼠肝臟，拍照稱重，并剪取大小適宜的肝組織，置于凍存管中，液氮保存，用以檢測(cè)肝組織中各mRNA及蛋白表達(dá)情況；另取1 cm×1 cm×0.5 cm 大小的肝組織以4% 多聚甲醛固定，用于病理形態(tài)學(xué)的觀察。

2.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)血清ALT、AST、SOD 活性及MDA、NEFA 水平，根據(jù)說明書取96 孔板，設(shè)置空白、標(biāo)準(zhǔn)品及樣品孔，且均設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，與工作液充分反應(yīng)后，將96孔板置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀中進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)其光密度（OD）值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，將各組均值帶入公式，再計(jì)算得出待測(cè)樣品的值，操作方法均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 肝臟脂質(zhì)水平檢測(cè) 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)肝組織TC、TG 水平，操作方法均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.6 大鼠肝臟指數(shù) 腹主動(dòng)脈采血后，頸椎脫臼處死大鼠，迅速剖取肝臟，生理鹽水清洗表面，用濾紙吸干后稱取肝臟濕重，計(jì)算肝臟指數(shù)，公式為肝臟指數(shù)＝肝臟濕重／體質(zhì)量×100%［10］。

2.7 HE 染色觀察肝組織病理學(xué)變化 取出于4%多聚甲醛固定液中的大鼠肝臟，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后，蘇木素染色，分化后伊紅染色，經(jīng)脫水、透明后滴加中性樹膠封片，光鏡下觀察。通過NAFLD 活動(dòng)度積分（NAFLD activity score，NAS）評(píng)價(jià)各組大鼠肝組織脂肪變性、小葉炎癥和氣球樣變程度［11］，評(píng)分范圍0～8（總分），評(píng)分越高表明脂肪變性、小葉炎癥、氣球樣變程度越高，見表1。

表1 NAS 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 NAS scoring standard

2.8 油紅O 染色觀察肝臟脂質(zhì)沉積情況 剪取大小適宜肝組織，于4%多聚甲醛固定液中固定4 h，脫水（20% 蔗糖溶液4 h，30% 蔗糖溶液過夜），OCT 冷凍包埋，冰凍切片，室溫干燥10 min，蒸餾水浸洗1 min，分化液分化2 min，油紅O 染液浸染20 min（避光），60%異丙醇分化10 s，蒸餾水洗滌，蘇木素復(fù)染5 min，1%鹽酸分化5 s，流水沖洗返藍(lán)，甘油明膠封片，顯微鏡檢，圖像采集。

2.9 RT-qPCR 法檢測(cè)肝組織LXRα、SREBP-1c、FASmRNA 表達(dá) 按照RNA 提取試劑盒說明書提取大鼠肝臟總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后加入擴(kuò)增反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，程序設(shè)定為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40 個(gè)循環(huán)。按2－ΔΔCT法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，序列見表2。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequences

2.10 免疫組化法檢測(cè)肝組織LXRα、SREBP-1c、FAS 蛋白表達(dá) 取各組大鼠肝組織，4%多聚甲醛固定，4～6 h 后更換固定液，石蠟包埋切片，免疫組化操作流程按病理檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行，用BA400Digital 數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，先于100 倍鏡下觀察完整切片組織，隨后每張切片選擇3 個(gè)區(qū)域采集400 倍顯微圖像，采用Image J 數(shù)據(jù)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算每張圖像陽性面積占比。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 26.0 軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，當(dāng)滿足正態(tài)性及方差齊性時(shí)用LSD 檢驗(yàn)，若不滿足正態(tài)或方差不齊時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 NAFLD 大鼠模型的評(píng)判 6 周造模結(jié)束后，與空白組比較，模型組大鼠血清ALT、AST 活性均升高（P＜0.05，P＜0.01），見表3。如圖1 所示，空白組大鼠肝組織中央靜脈周圍的肝細(xì)胞形態(tài)一致，單行排列，呈索狀，排布有序，并呈放射狀分布，細(xì)胞核圓且居中，胞漿分布均勻；模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂，胞漿疏松腫脹呈空泡化，胞內(nèi)見大小不等的空泡，脂肪變性明顯，觀察到有廣泛較大的脂肪滴，肝細(xì)胞核被擠壓而明顯偏位，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。根據(jù)血清生化水平及病理切片提示NAFLD 模型建立成功。

表3 各組大鼠血清ALT、AST 活性比較（U／L，±s，n＝5）Tab.3 Comparison of serum ALT and AST activities in each group of rats（U／L，±s， n＝5）

表3 各組大鼠血清ALT、AST 活性比較（U／L，±s，n＝5）Tab.3 Comparison of serum ALT and AST activities in each group of rats（U／L，±s， n＝5）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態(tài)變化（HE，×200）Fig.1 Pathological changes of liver tissue in rats of each group（HE，×200）

3.2 六味降脂湯對(duì)NAFLD 大鼠血清ALT、AST、SOD 活性及MDA 水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清ALT、AST 活性升高（P＜0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組大鼠血清ALT 活性無明顯變化（P＞0.05），AST 活性降低（P＜0.01），六味降脂湯各劑量組血清ALT、AST 活性降低（P＜0.05，P＜0.01）；與阿托伐他汀組比較，六味降脂湯各劑量組大鼠血清ALT 活性降低（P＜0.05，P＜0.01）。在抗氧化能力方面，與空白組比較，模型組大鼠血清SOD 活性降低（P＜0.01），MDA 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組及六味降脂湯低、中劑量組大鼠血清SOD 活性均升高（P＜0.05，P＜0.01），各給藥組 MDA 水平均降低（P＜0.01），見表4。

表4 六味降脂湯對(duì)NAFLD 大鼠血清ALT、AST、SOD 活性及MDA 水平的影響（±s， n＝7）Tab.4 Effects of Liuwei Jiangzhi Decoction on serum ALT，AST，SOD activities and MDA levels of NAFLD rats（±s，n＝7）

表4 六味降脂湯對(duì)NAFLD 大鼠血清ALT、AST、SOD 活性及MDA 水平的影響（±s， n＝7）Tab.4 Effects of Liuwei Jiangzhi Decoction on serum ALT，AST，SOD activities and MDA levels of NAFLD rats（±s，n＝7）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與阿托伐他汀組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.3 六味降脂湯對(duì)NAFLD 大鼠肝組織TC、TG及血清NEFA 水平、肝臟指數(shù)的影響 與空白組比較，模型組大鼠肝組織TC、TG 及血清NEFA 水平、肝臟指數(shù)均升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織TC、TG 水平及血清NEFA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），六味降脂湯低、中劑量組大鼠肝臟指數(shù)均降低（P＜0.05）；與阿托伐他汀組比較，六味降脂湯低劑量組大鼠肝組織TC 水平及各劑量組TG 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），六味降脂湯高劑量組大鼠血清NEFA 水平升高（P＜0.01），見表5。

表5 六味降脂湯對(duì)NAFLD 大鼠肝組織TC、TG 及血清NEFA 水平、肝臟指數(shù)的影響（±s， n＝7）Tab.5 Effects of Liuwei Jiangzhi Decoction on levels of hepatic TC and TG，serum NEFA，and liver index of NAFLD rats（±s， n＝7）

表5 六味降脂湯對(duì)NAFLD 大鼠肝組織TC、TG 及血清NEFA 水平、肝臟指數(shù)的影響（±s， n＝7）Tab.5 Effects of Liuwei Jiangzhi Decoction on levels of hepatic TC and TG，serum NEFA，and liver index of NAFLD rats（±s， n＝7）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與阿托伐他汀組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.4 六味降脂湯對(duì)NAFLD 大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響 肉眼觀察可見空白組大鼠肝組織呈紅褐色，質(zhì)軟而脆；模型組大鼠肝組織體積略增大，邊緣圓鈍，色黃，包膜緊張光滑，質(zhì)地油潤(rùn)；與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織病變情況得到不同程度的改善。HE 染色顯示空白組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝血竇位于肝索細(xì)胞之間，大小不等，并與中央靜脈相互連通，中央靜脈周圍的肝細(xì)胞形態(tài)一致、單行排列、呈索狀、排布有序、并呈放射狀分布，胞核圓且居中，胞漿分布均勻；與空白組比較，模型組大鼠肝組織可觀察到明顯的脂肪變性、小葉炎癥、氣球樣變等病理變化，NAS 評(píng)分升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織損傷程度減輕，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列較為完整有序，脂肪空泡數(shù)量有著不同程度的減少，肝組織脂肪蓄積及細(xì)胞空泡化得到明顯改善，NAS 評(píng)分降低（P＜0.01）。油紅O 染色顯示空白組大鼠肝組織中未見橘紅色脂滴；模型組肝組織內(nèi)出現(xiàn)廣泛大量的橘紅色脂滴，體積較大，且部分脂滴融合成片，提示肝組織內(nèi)存在大量脂質(zhì)沉積；與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織內(nèi)脂滴密度有所減少，脂質(zhì)沉積情況得到改善，見圖2～3。

圖2 各組大鼠肝組織病理形態(tài)觀察Fig.2 Pathological observation of liver tissue of rats in each group

圖3 六味降脂湯對(duì)NAFLD 大鼠肝組織NAS 評(píng)分的影響（±s， n＝6）Fig.3 Effects of Liuwei Jiangzhi Decoction on hepatic NAS score of NAFLD rats（±s， n＝6）

3.5 六味降脂湯對(duì)NAFLD 大鼠肝組織LXRα、SREBP-1c、FASmRNA 表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠肝組 織LXRα、SREBP-1c、FASmRNA 表達(dá)均升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織LXRα、SREBP-1c、FASmRNA表達(dá)均降低（P＜0.01）；與阿托伐他汀組比較，六味降脂湯中劑量組LXRα、FASmRNA 表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖4。

圖4 六味降脂湯對(duì)NAFLD 大鼠肝組織LXRα、 SREBP-1c、 FAS mRNA 表達(dá)的影響（±s， n＝3）Fig.4 Effects of Liuwei Jiangzhi Decoction on the hepatic mRNA expressions of LXRα， SREBP-1c and FAS of NAFLD rats（±s， n＝3）

3.6 六味降脂湯對(duì)NAFLD 大鼠肝組織LXRα、SREBP-1c、FAS 蛋白表達(dá)的影響 IHC 結(jié)果顯示，陽性表達(dá)為肝細(xì)胞胞漿及胞膜有棕黃色顆粒沉著，與空白組比較，模型組大鼠肝組織SREBP-1c、FAS 陽性表達(dá)率升高（P＜0.01），LXRα 表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織SREBP-1c、FAS 陽性表達(dá)率降低（P＜0.01），阿托伐他汀組LXRα 陽性表達(dá)率降低（P＜0.05），六味降脂湯各劑量組LXRα 表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；與阿托伐他汀組比較，六味降脂湯高劑量組SREBP-1c、FAS 陽性表達(dá)率升高（P＜0.05，P＜0.01），見表6、圖5。Western blot 結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠肝組織SREBP-1c 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織SREBP-1c 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）；與阿托伐他汀組比較，六味降脂湯低劑量組大鼠肝組織SREBP-1c 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見圖6。

圖5 各組大鼠肝組織LXRα、SREBP-1c、FAS 陽性表達(dá)觀察（IHC，×400）Fig.5 Observation on the hepatic positive expressions of LXRα，SREBP-1c and FAS of rats in each group（IHC，×400）

圖6 六味降脂湯對(duì)NAFLD 大鼠肝組織SREBP-1c 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）Fig.6 Effects of Liuwei Jiangzhi Decoction on the hepatic protein expression of SREBP-1c of NAFLD rats（±s， n＝3）

表6 六味降脂湯對(duì)NAFLD 大鼠肝組織LXRα、SREBP-1c、FAS 陽性表達(dá)率的影響（%，±s， n＝3）Tab.6 Effects of Liuwei Jiangzhi Decoction on the hepatic positive expression rate of LXRα，SREBP-1c and FAS of NAFLD rats（%，±s， n＝3）

表6 六味降脂湯對(duì)NAFLD 大鼠肝組織LXRα、SREBP-1c、FAS 陽性表達(dá)率的影響（%，±s， n＝3）Tab.6 Effects of Liuwei Jiangzhi Decoction on the hepatic positive expression rate of LXRα，SREBP-1c and FAS of NAFLD rats（%，±s， n＝3）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與阿托伐他汀組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

4 討論

中醫(yī)學(xué)中本無NAFLD 的病名，但根據(jù)癥狀、病因病機(jī)及致病特點(diǎn)等，將其歸屬于“肝癖” “脅痛” 等范疇［7］，推測(cè)NAFLD 初期發(fā)病病位在肝，責(zé)之于脾，久則導(dǎo)致肝失疏泄，濕熱痰瘀痹阻于肝絡(luò)。六味降脂湯由茵陳、丹參、絞股藍(lán)、生山楂、決明子、荷葉組成，方中茵陳苦寒降泄，善清肝膽之熱而利濕，兼理肝膽之郁為君藥；丹參入心、肝二經(jīng)，活血化瘀，二藥合用共奏清熱利濕化瘀之功，共為君藥；絞股藍(lán)益氣健脾，以助茵陳化濕祛痰，君臣相配，相輔相成，使化濕祛痰之力益彰；生山楂助丹參活血化瘀，兼有化濁降脂之效，與絞股藍(lán)同為臣藥；決明子潤(rùn)腸通便兼以清肝，使?jié)駸嶂坝衅渫?，而全方偏苦寒沉降，取荷葉輕清之性，使之升降相應(yīng)，陰陽相濟(jì)，兩藥共為佐使。該方諸藥相伍，升降相應(yīng)、補(bǔ)泄兼施、陰陽相濟(jì)，共奏清熱利濕、健脾化痰、活血化瘀之功。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示六味降脂湯各劑量給藥后，能降低NAFLD大鼠血清ALT、AST 活性及NEFA 水平，調(diào)節(jié)脂代謝紊亂，提升其抗氧化能力，尤以在降低ALT 活性方面較陽性組（阿托伐他?。┬Ч@著。以上結(jié)果表明，六味降脂湯能改善NAFLD 大鼠肝臟脂質(zhì)沉積，提升其抗氧化能力及保護(hù)肝功能，減緩NAFLD 病變的發(fā)展。

肝臟是人體內(nèi)關(guān)鍵代謝器官，參與內(nèi)源性脂肪的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)［12］，而LXRα 是肝臟脂肪新生的調(diào)節(jié)因子［13］，當(dāng)LXRα 過表達(dá)可激活調(diào)控脂肪代謝的SREBP-1c 及控制脂肪酸合成的重要調(diào)節(jié)因子FAS，導(dǎo)致大量脂肪酸內(nèi)流集聚于肝臟，誘發(fā)NAFLD［14-15］。SREBP-1c 主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核膜上，在調(diào)節(jié)糖脂代謝方面具有重要意義［16］。當(dāng)敲除ob／ob 小鼠SREBP-1 基因后，肝臟TG 水平較未敲除小鼠下降50%，提示SREBP-1 極大地促進(jìn)了NAFLD 形成［17］。而FAS 是促使脂肪酸合成的關(guān)鍵因子，其表達(dá)受其上游核轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c的調(diào)控，下調(diào)NAFLD 大鼠SREBP-1c、FAS 基因表達(dá)，可減輕脂肪酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和肝臟脂質(zhì)沉積［18］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織SREBP-1c、FAS 蛋白表達(dá)較空白組均升高，提示高脂飲食合并高脂乳劑灌胃可能通過激活SREBP-1c-FAS 信號(hào)通路，促使脂質(zhì)合成且堆積于肝臟，從而導(dǎo)致NAFLD，與陳麗如［19］研究結(jié)果趨同；六味降脂湯干預(yù)后NAFLD 大鼠肝組織SREBP-1c、FAS 蛋白表達(dá)均下降，而各組大鼠肝組織LXRα 蛋白表達(dá)無明顯變化，據(jù)相關(guān)研究顯示SREBP-1c 亦作為腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號(hào)分子的下游蛋白［20］，活化的AMPK 可抑制SREBP-1c 的入核［21］，因此推斷六味降脂湯干預(yù)后可能通過上調(diào)AMPK 抑制SREBP-1c 及其下游脂肪酸合成相關(guān)因子的表達(dá)，從而調(diào)控肝臟脂肪酸代謝和抗氧化應(yīng)激，進(jìn)而干預(yù)NAFLD。此外六味降脂湯治療NAFLD 也可能是組方中不同藥理作用交匯調(diào)控的結(jié)果，但還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，六味降脂湯具有調(diào)控肝臟脂肪酸代謝，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而治療NAFLD 的作用，其潛在機(jī)制可能與抑制SREBP-1c-FAS 信號(hào)通路有關(guān)。