李建茹舒蒙蒙方育恩倪 萌馬惠榮宋翠淼*

（1.河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200； 2.河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，河北 石家莊 050200； 3.河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點實驗室，河北 石家莊 050200； 4.河北省中西醫(yī)結(jié)合生殖疾病協(xié)同創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050200）

卵巢儲備功能下降是卵巢衰老或衰竭的前期狀態(tài)，是由卵巢內(nèi)可募集的卵泡數(shù)量減少或可受精的卵母細(xì)胞能力下降所造成［1］。近年來，隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、環(huán)境的改變及生育年齡的延后，卵巢儲備功能下降的發(fā)病率逐年上升，約10% 不孕和32%體外受精和胚胎移植周期失敗與卵巢儲備功能下降有關(guān)［2］。研究顯示，卵巢組織中鐵水平與卵巢儲備功能呈負(fù)相關(guān)［3-4］，體內(nèi)鐵超載患者多伴隨卵巢功能減退［5］。課題組前期研究顯示，卵巢儲備功能下降大鼠卵巢的氧化應(yīng)激反應(yīng)加重［6］。研究證實，氧化應(yīng)激的發(fā)生與鐵代謝異常有關(guān)［7］，而鐵代謝異?？捎绊懣寡趸傅暮铣?，導(dǎo)致組織氧化損傷及細(xì)胞凋亡［8］。因此，卵巢組織鐵代謝異?？蓪?dǎo)致氧化損傷，造成卵巢儲備功能下降。

補腎法的代表方資癸益沖方是全國名中醫(yī)杜惠蘭教授20 多年來有效防治卵巢功能下降的經(jīng)驗方，具有補腎扶脾、調(diào)補精血作用。前期研究顯示，資癸益沖方可改善卵巢儲備功能下降患者和模型大鼠的氧化應(yīng)激水平，提高卵巢的儲備功能［6，9-10］。本實驗通過建立卵巢儲備功能下降大鼠模型，觀察資癸益沖方對其卵巢組織鐵代謝調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡及卵巢儲備功能的影響，以期為中醫(yī)臨床治療卵巢儲備功能下降提供理論和實驗的依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級雌性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量（300±20）g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）2020-0001，飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學(xué)院科研中心，室溫（23±2）℃，通風(fēng)良好，光照明暗各12 h，期間給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、充足飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，實驗動物使用許可證號SYXK（冀）2017-005，本實驗所涉及的相關(guān)操作均經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院倫理委員會審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號YXLL2021013）。

1.2 藥物

1.2.1 中藥 資癸益沖方（由熟地、枸杞子、當(dāng)歸、白芍、山萸肉、女貞子、炙黃芪、黨參、白術(shù)、香附等組成）所用藥物為顆粒劑，購自神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，按照“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表” 進(jìn)行換算，配制成2.1 g／mL 的藥液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 西藥輔酶 Q10膠囊（國藥準(zhǔn)字H19999132）購自上海上藥信誼藥廠有限公司，配制成0.47 mg／mL 的藥液備用；注射用環(huán)磷酰胺（CTX）（0.2 g／瓶，國藥準(zhǔn)字H20160467）購自德國Baxter Oncology GmbH 公司，配制成10 mg／mL的藥液備用。

1.3 試劑 抗苗勒管激素（AMH）（批號HY-10140）、雌二醇（E2）（批號RG61812）、卵泡刺激素（FSH）試劑盒（批號RG11812）均購自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司；TUNEL 試劑盒（批號11684817910）購自瑞士Roche 公司；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）抗體（批號NB100-92243）購自美國Novus 公司；二價金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白1（divalent metal ion transporter 1，DMT1）抗體（批號ab55735）、膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1（ferroportin 1，F(xiàn)PN1）抗體（批號ab239583）購自英國Abcam 公司。

1.4 儀器 酶標(biāo)儀（南通邁迪檢測儀器有限公司，型號Versa Max）；電泳槽及電泳儀（北京六一儀器廠，型號DYY）；顯微圖像分析系統(tǒng)（武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司，型號HMIAS-2000）；電動玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號DY89-1）；恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司，型號SHA-B）；實時熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司，型號CFX96）；凝膠成像儀（美國GE 公司，型號Image Quant LAS4010）。

2 方法

2.1 分組與造模 通過陰道脫落細(xì)胞涂片選取40只動情周期規(guī)律大鼠，隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、資癸益沖方組和輔酶Q10組，每組10 只。在課題組前期研究［6］基礎(chǔ)上，參考文獻(xiàn)［11］報道，通過一次性腹腔注射CTX（75 mg／kg）建立卵巢儲備功能下降大鼠模型。于造模后第2 天開始，每天上午8：00 進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片，連續(xù)10 d，當(dāng)陰道脫落細(xì)胞涂片出現(xiàn)動情周期紊亂或延長則提示造模成功。

2.2 給藥 造模成功后，資癸益沖方組灌胃給予14 g／kg 資癸益沖方顆粒劑溶液；輔酶Q10組灌胃給予3.15 mg／kg 輔酶Q10溶液；模型組和正常組灌胃給予等量蒸餾水，連續(xù)14 d。

2.3 取材 給藥結(jié)束后進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片，所有大鼠禁食不禁水，在動情前期，腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg／kg，麻醉處死大鼠，股動脈取血，快速無菌方法留取卵巢組織，將每只大鼠的左側(cè)卵巢保存于－70 ℃冰箱，右側(cè)卵巢放置于4%多聚甲醛中固定。

2.4 檢測指標(biāo)

2.4.1 觀察大鼠動情周期變化 給藥結(jié)束后，每天上午8：00 進(jìn)行大鼠陰道脫落上皮細(xì)胞涂片，于顯微鏡下觀察大鼠動情周期變化。

2.4.2 ELISA 法檢測大鼠血清AMH、E2、FSH 水平 將大鼠血液靜置30 min，離心，分離得血清。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀測定吸光度值并計算AMH、E2、FSH 水平。

2.4.3 HE 染色觀察卵巢組織各級卵泡數(shù)量 各組按照隨機(jī)數(shù)字表法選取6 只大鼠卵巢組織，石蠟包埋，切片，HE 染色，每張切片先于40 倍光學(xué)顯微鏡下觀察全部組織各級卵泡數(shù)量，再于100 倍鏡下觀察具體卵泡變化。

2.4.4 普魯士藍(lán)染色觀察卵巢組織鐵沉積 各組按照隨機(jī)數(shù)字表法選取6 張卵巢組織切片，常規(guī)脫蠟、水化，Perl’s 染色液染色20 min，核固紅試劑B 染核5 min，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢組織細(xì)胞藍(lán)色顆粒。通過Image J 1.8.0 圖像分析軟件測量并計算普魯士藍(lán)染色陽性面積占總面積的百分比。

2.4.5 TUNEL 法檢測卵巢組織細(xì)胞凋亡 取卵巢組織石蠟切片，按照TUNEL 試劑盒說明書步驟操作，加入3% H2O2-甲醇混合溶液，TUNEL 反應(yīng)液和過氧化物酶37 ℃孵育，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。各組按隨機(jī)數(shù)字表法選取6 只大鼠的卵巢組織石蠟切片進(jìn)行TUNEL 染色，記錄每個視野下細(xì)胞核呈棕褐色表達(dá)的細(xì)胞數(shù)并計算凋亡指數(shù)，公式為凋亡指數(shù)＝陽性細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.4.6 Western blot 法檢測卵巢組織鐵代謝調(diào)節(jié)蛋白TFR1、DMT1、FPN1 的表達(dá) 提取卵巢組織蛋白，每孔上樣等量總蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育1 h，充分洗膜后，應(yīng)用ECL 化學(xué)發(fā)光法檢測，以β-actin 為內(nèi)參，對目的蛋白分別進(jìn)行灰度值分析。每組結(jié)果相同條件至少重復(fù)3 次并取平均值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 23.0 軟件進(jìn)行處理，計量資料以（±s）表示，先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 資癸益沖方對大鼠動情周期變化的影響 正常組大鼠的動情周期約為4 d，分別是動情期（無核角化細(xì)胞為主）、動情后期（角化細(xì)胞、有核細(xì)胞、白細(xì)胞三者共存）、動情間期（白細(xì)胞為主）、動情前期（有核細(xì)胞為主）。與正常組比較，模型組大鼠出現(xiàn)動情周期紊亂，動情間期延長；與模型組比較，資癸益沖方組和輔酶Q10組大鼠動情紊亂周期縮短，動情周期恢復(fù)，見圖1～2。

圖1 各組大鼠動情周期陰道脫落細(xì)胞美蘭染色（×100）Fig.1 Methylene blue staining of vaginal exfoliated cells of rats in each group during estrous cycle（×100）

圖2 各組大鼠動情周期變化曲線Fig.2 Estrous cycle change curves of rats in each group

3.2 資癸益沖方對大鼠血清AMH、E2、FSH 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清AMH、E2水 平降 低（P＜0.05），F(xiàn)SH 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，資癸益沖方組和輔酶Q10組大鼠血清AMH、E2水平升高（P＜0.05），F(xiàn)SH水平降低（P＜0.05）；與輔酶Q10組比較，資癸益沖方組大鼠血清AMH、E2、FSH 水平無明顯變化（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清AMH、E2、FSH 水平比較（±s， n＝10）Tab.1 Comparison of serum AMH，E2 and FSH levels of rats in each group（±s， n＝10）

表1 各組大鼠血清AMH、E2、FSH 水平比較（±s， n＝10）Tab.1 Comparison of serum AMH，E2 and FSH levels of rats in each group（±s， n＝10）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

3.3 資癸益沖方對大鼠卵巢組織各級卵泡數(shù)量的影響 正常組大鼠卵巢組織可見原始卵泡、生長卵泡和黃體，顆粒細(xì)胞層排列緊密有序；與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織原始卵泡數(shù)、生長卵泡數(shù)及黃體數(shù)減少（P＜0.05），閉鎖卵泡數(shù)增多（P＜0.05）；與模型組比較，資癸益沖方組和輔酶Q10組大鼠卵巢組織原始卵泡數(shù)、生長卵泡數(shù)及黃體數(shù)增多（P＜0.05），閉鎖卵泡數(shù)減少（P＜0.05）；與輔酶Q10組比較，資癸益沖方組大鼠卵巢組織原始卵泡數(shù)、生長卵泡數(shù)、黃體數(shù)、閉鎖卵泡數(shù)均無明顯變化（P＞0.05），見表2、圖3。

圖3 各組大鼠卵巢組織HE 染色（×100）Fig.3 HE staining of ovarian tissue of rats in each group（×100）

表2 各組大鼠卵巢組織生長卵泡數(shù)、黃體數(shù)、閉鎖卵泡數(shù)比較（±s， n＝6）Tab.2 Comparison of the number of growing follicles，corpus luteum and follicular atresia in ovarian tissue of rats in each group（±s， n＝6）

表2 各組大鼠卵巢組織生長卵泡數(shù)、黃體數(shù)、閉鎖卵泡數(shù)比較（±s， n＝6）Tab.2 Comparison of the number of growing follicles，corpus luteum and follicular atresia in ovarian tissue of rats in each group（±s， n＝6）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

3.4 資癸益沖方對大鼠卵巢組織鐵沉積及細(xì)胞凋亡的影響 普魯士藍(lán)染色顯示卵巢組織鐵沉積主要發(fā)生在卵巢皮質(zhì)，位于大的竇狀卵泡或黃體；普魯士藍(lán)顆?？梢娪陬w粒細(xì)胞、膜細(xì)胞和間質(zhì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織鐵沉積（普魯士藍(lán)染色陽性面積百分比）增加（P＜0.05）；與模型組比較，資癸益沖方組和輔酶Q10組大鼠卵巢組織鐵沉積減少（P＜0.05）；與輔酶Q10組比較，資癸益沖方組大鼠卵巢組織鐵沉積無明顯變化（P＞0.05），見圖4、表3。

圖4 各組大鼠卵巢組織普魯士藍(lán)染色（×200）Fig.4 Prussian blue staining of ovarian tissue of rats in each group（×200）

表3 各組大鼠卵巢組織鐵沉積及凋亡指數(shù)比較（%，±s， n＝6）Tab.3 Comparison of iron deposition and apoptosis index in ovarian tissue of rats in each group（%，±s，n＝6）

表3 各組大鼠卵巢組織鐵沉積及凋亡指數(shù)比較（%，±s， n＝6）Tab.3 Comparison of iron deposition and apoptosis index in ovarian tissue of rats in each group（%，±s，n＝6）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

卵巢組織凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色，主要分布在卵泡顆粒細(xì)胞層、閉鎖卵泡及萎縮的黃體。正常組大鼠卵巢組織可見少量凋亡的顆粒細(xì)胞；與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織顆粒細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)量增多，細(xì)胞凋亡指數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組比較，資癸益沖方組和輔酶Q10組大鼠卵巢組織顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，細(xì)胞凋亡指數(shù)降低（P＜0.05）；與輔酶Q10組比較，資癸益沖方組大鼠卵巢組織細(xì)胞凋亡指數(shù)無明顯變化（P＞0.05），見圖5、表3。

圖5 各組大鼠卵巢組織TUNEL 染色（×400）Fig.5 TUNEL staining of ovarian tissue of rats in each group（×400）

3.5 資癸益沖方對大鼠卵巢組織鐵代謝調(diào)節(jié)蛋白TFR1、DMT1、FPN1 表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織TFR1、DMT1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），F(xiàn)PN1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與模型組比較，資癸益沖方組和輔酶Q10組大鼠卵巢組織TFR1、DMT1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），F(xiàn)PN1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與輔酶Q10組比較，資癸益沖方組大鼠卵巢組織TFR1、DMT1、FPN1 蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），見圖6、表4。

圖6 各組大鼠卵巢組織TFR1、DMT1、FPN1 蛋白電泳圖Fig.6 Protein electrophoresis of TFR1，DMT1 and FPN1 in ovarian tissue of rats in each group

表4 各組大鼠卵巢組織TFR1、DMT1、FPN1 蛋白表達(dá)比較（±s， n＝3）Tab.4 Comparison of the protein expressions of TFR1，DMT1 and FPN1 in ovarian tissue of rats in each group（±s， n＝3）

表4 各組大鼠卵巢組織TFR1、DMT1、FPN1 蛋白表達(dá)比較（±s， n＝3）Tab.4 Comparison of the protein expressions of TFR1，DMT1 and FPN1 in ovarian tissue of rats in each group（±s， n＝3）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為，腎藏精、主生殖，腎精包含先天之精和后天之精，先天之精是生育繁殖的最基本物質(zhì)，與生殖和衰老密切相關(guān)；后天之精是水谷之精，滋養(yǎng)各組織器官并促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育。卵巢屬先天之精，其功能發(fā)揮需靠后天水谷之精的滋養(yǎng)，先、后天之精不足，可導(dǎo)致卵巢失養(yǎng)，經(jīng)孕失調(diào)，生育功能減退。故腎精虧虛是卵巢儲備功能下降的基本病機(jī)，補腎填精、健脾益氣養(yǎng)血是其治療方法［12-13］。資癸益沖方中熟地等為君藥，滋補肝腎，填精養(yǎng)血；女貞子、山萸肉等補腎肝養(yǎng)精血以資先天，黨參、白術(shù)等健脾益氣而資后天，共為臣藥；當(dāng)歸、白芍調(diào)經(jīng)養(yǎng)血理沖任，香附疏肝理氣，共為佐使，諸藥合用，使先后天同補，助精血以達(dá)資癸益沖之效。

環(huán)磷酰胺（CTX）是臨床上對卵巢功能損傷最大的化療藥物之一，可使卵巢細(xì)胞DNA 鏈斷裂，干擾蛋白質(zhì)和核酸的合成，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，卵巢儲備減退［14］。研究證明，采用75 mg／kg CTX 一次性腹腔注射能夠成功建立卵巢儲備功能下降大鼠模型，此方法操作簡便且成功率高［15］。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠動情周期紊亂，血清AMH、E2水平降低，F(xiàn)SH 水平升高，卵巢組織中各級生長卵泡數(shù)量減少，閉鎖卵泡增多，提示卵巢儲備下降，造模成功；資癸益沖方干預(yù)后，大鼠各項指標(biāo)好轉(zhuǎn)，表明資癸益沖方可改善卵巢儲備功能下降。

氧化損傷是造成卵巢儲備功能下降的重要機(jī)制之一［16］。研究發(fā)現(xiàn)，鐵代謝異常致鐵超載可增加卵巢組織的氧化損傷，破壞“下丘腦-垂體-性腺軸”，造成卵巢衰老及功能減退［17-19］。課題組同期研究結(jié)果（暫未見刊）顯示，卵巢儲備功能下降大鼠卵巢組織鐵水平升高，結(jié)合普魯士藍(lán)染色推測卵巢儲備減退可能與卵巢鐵超載有關(guān)。TFR1、DMT1 和FPN1 是調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵代謝的重要因素，影響細(xì)胞鐵的吸收和釋放。鐵由TFR1 吸收進(jìn)入細(xì)胞，通過DMT1 進(jìn)行儲存［20］，并由跨膜蛋白FPN1釋放到血液中［21］。本實驗結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織TFR1、DMT1 蛋白表達(dá)升高，F(xiàn)PN1 蛋白表達(dá)降低，表明細(xì)胞鐵吸收儲存增多而排出減少，從而導(dǎo)致卵巢鐵超載；資癸益沖方干預(yù)后，大鼠卵巢組織TFR1、DMT1 蛋白表達(dá)降低，F(xiàn)PN1 蛋白表達(dá)升高，卵巢組織鐵沉積和細(xì)胞凋亡程度減輕，卵巢儲備改善，這與課題組前期研究結(jié)果一致［6］。

綜上所述，資癸益沖方可明顯改善卵巢儲備功能下降大鼠的卵巢儲備功能，其機(jī)制可能與影響卵巢組織鐵代謝調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，抑制鐵超載，減輕氧化損傷和細(xì)胞凋亡有關(guān)。