段麗穎，任欠欠，杜義龍，李艷榮，趙勝男，潘海峰

（承德醫(yī)學(xué)院，河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德 067000）

山楂葉為薔薇科山楂屬植物山里紅Crataegus pinnatifidaBge.var.majorN.E.Br 或山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥葉，具有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂的功效，收錄于2020 年版《中國(guó)藥典》［1］中，常用于治療冠心病、心絞痛等心腦血管疾?。?］。現(xiàn)代研究表明，山楂葉富含黃酮類、萜類、有機(jī)酸等化合物［3］，其中總黃酮是其發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化、降壓降脂、增加冠脈血流量等作用的主要活性成分［4-5］，并且在改善糖脂代謝紊亂、降低血糖血脂方面也發(fā)揮著重要作用［6-7］，但對(duì)其降低血糖方面的研究尚不完善。

中藥所含化學(xué)成分較為復(fù)雜，指紋圖譜可反映其整體性［8］，同時(shí)借助聚類熱圖能以更直觀的方式展現(xiàn)數(shù)據(jù)疏密、樣品地區(qū)差異的變化，并且通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可進(jìn)行全面質(zhì)量評(píng)價(jià)［9］。因此，本實(shí)驗(yàn)以體外抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性試驗(yàn)考察山楂葉降糖作用，同時(shí)建立不同產(chǎn)地樣品UPLC 指紋圖譜，并采用雙變量相關(guān)分析、熱圖、聚類分析、主成分分析對(duì)該藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，以期為其產(chǎn)地區(qū)分及質(zhì)量研究提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters Acquity 超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；Multiskan FC 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；JA5003 上皿天平（千分之一，天津天馬衡基儀器有限公司）；AG245電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DHG-9070A 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州榮華儀器制造有限公司）；WIGGENS TM-1 渦旋振蕩器（北京桑翌實(shí)驗(yàn)儀器研究所）；HC-2062 高速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；KQ-700 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TCP-010-096潔特細(xì)胞培養(yǎng)板（廣州潔特生物過(guò)濾股份有限公司）；實(shí)驗(yàn)室PH 計(jì)［瑞士梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；FW100 高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；MH-2 微型振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 試劑與藥物 α-淀粉酶（豬胰腺）（批號(hào)RM19Y304）、α-葡萄糖苷酶（批號(hào)RM20Y1225）、對(duì)硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG，批號(hào)RM20Y807）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；阿卡波糖（批號(hào)113HO31，北京索萊寶科技有限公司）；淀粉（批號(hào)RM1248-50KU，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）。

綠原酸（批號(hào)18071907）、牡荊素葡萄糖苷（批號(hào) 20042305）、牡荊素鼠李糖苷（批號(hào)18060103）、牡荊素（批號(hào)16070601）、蘆丁（批號(hào)18122901）、金絲桃苷（批號(hào)19103001）、異槲皮素（批號(hào)18062702）對(duì)照品均購(gòu)自成都普菲得生物技術(shù)有限公司。甲醇、乙腈、四氫呋喃為色譜純，均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；甲酸為分析純；水為純凈水（批號(hào)JYSPYL2027，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

山楂葉共15 批，于2020 年11 月采自全國(guó)各地，經(jīng)全國(guó)老中醫(yī)藥專家（傳統(tǒng)鑒定）學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承人孫寶惠主任藥師鑒定為薔薇科山楂屬植物山里紅Crataegus pinnatifidaBge.var.majorN.E.Br的干燥葉，均符合2020 年版《中國(guó)藥典》 一部項(xiàng)下要求，具體見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC 指紋圖譜建立

2.1.1 溶液制備

2.1.1.1 供試品溶液 山楂葉經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)80 目篩，取約1.0 g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，加入50 mL 60%甲醇，稱定質(zhì)量，密封，超聲處理30 min 后靜置15 min，60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，12 000 r／min 離心10 min，取上層清液，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得（質(zhì)量濃度約為20 mg／mL）。

2.1.1.2 對(duì)照品溶液 精密稱取綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮素對(duì)照品適量，50%甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為38.13、10.28、14.02、5.73、8.52、5.95、8.52 μg／mL 的溶液，即得。

2.1.2 色譜條件 ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相水（含0.1%甲酸）（A）-（乙腈-四氫呋喃-甲酸）（120∶10∶0.1）（B），梯度洗脫（0～6 min，92%～89%A；6～10 min，89%～83% A；10～15 min，83%～83.5%A；15～18 min，83.5%～80%A；18～20 min，80%～66%A；20～22 min，66%～0A；22～24 min，0A）；體積流量0.2 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm；進(jìn)樣量2 μL；樣品室溫度25 ℃。

2.1.3 方法學(xué)考察

2.1.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（S2），在“2.1.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD 均小于3%，相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于1%，表明儀器精密度良好。

2.1.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（S2），于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD 均小于3%，相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于1%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材（S2），按“2.1.1.1” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD 均小于3%，相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4 圖譜生成 取對(duì)照品、供試品溶液適量，在“2.1.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以S1 圖譜為參照，設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.2 min，多點(diǎn)校正后采用中位數(shù)法生成指紋圖譜（圖1），以穩(wěn)定性較好的23 個(gè)色譜峰為共有峰。再采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004A 版）對(duì)15 批樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表2。然后，通過(guò)對(duì)照品色譜圖（圖2）對(duì)共有峰進(jìn)行指認(rèn)，確定5、16、18、19、21、22、23 號(hào)色譜峰分別為綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮素。

圖1 15 批樣品UPLC 指紋圖譜Fig.1 UPLC fingerprints for fifteen batches of samples

表2 15 批樣品相似度Tab.2 Similarities of fifteen batches of samples

圖2 對(duì)照品UPLC 色譜圖Fig.2 UPLC chromatogram of reference substances

2.2 降糖活性研究 參考文獻(xiàn)［10］報(bào)道，并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件稍加調(diào)整。

2.2.1 溶液制備

2.2.1.1 樣品溶液 取“2.1.1.1” 項(xiàng)下供試品溶液續(xù)濾液1 mL 至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后以等體積PBS 緩沖液（pH 6.8）復(fù)溶，即得（質(zhì)量濃度約為20 mg／mL）。

2.2.1.2 阿卡波糖溶液 稱取阿卡波糖（陽(yáng)性藥）適量，PBS 緩沖液溶解，得1 mg／mL 母液，PBS 緩沖液稀釋成系列質(zhì)量濃度，即得。

2.2.2 α-淀粉酶活性抑制實(shí)驗(yàn) 取20 μL 不同質(zhì)量濃度樣品溶液至1 mL 離心管中，再加入20 μL 0.35 U／mL α-淀粉酶溶液，渦旋5 s 并瞬時(shí)離心后在37 ℃下孵育15 min，加入20 μL 0.15%淀粉溶液，渦旋離心，在37 ℃下孵育15 min，加入80 μL DNS 溶液終止反應(yīng)，煮沸5 min 后冰水浴冷卻至室溫，將離心管內(nèi)的溶液轉(zhuǎn)移至96 孔板中，酶標(biāo)儀上于540 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值，每個(gè)質(zhì)量濃度平行3 份，作為樣品組；以等體積PBS 緩沖液代替α-淀粉酶溶液，其他操作同上，作為樣品對(duì)照組；以等體積PBS 緩沖液代替樣品溶液，其他操作同上，作為對(duì)照組；以等體積PBS 緩沖液代替樣品、α-淀粉酶溶液，其他操作同上，作為空白組；以等體積不同質(zhì)量濃度阿卡波糖溶液代替樣品溶液，其他操作同上，作為陽(yáng)性對(duì)照組，計(jì)算抑制率，公式為抑制率（%）＝｛［（對(duì)照組吸光度－空白組吸光度）－（樣品組吸光度－ 樣品對(duì)照組吸光度）］／（對(duì)照組吸光度－ 空白組吸光度）｝ × 100%，再將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 21.0 軟件計(jì)算IC50值，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 α-淀粉酶雙變量相關(guān)分析、色譜峰篩選、IC50值、主成分評(píng)分Tab.3 Bivariate correlation analysis，chromatographic peak screening，IC50 values and principal component scores for αpancreatic amylase

2.2.3 α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗(yàn) 在96 孔板中加入60 μL PBS 溶液，再加入20 μL 不同質(zhì)量濃度樣品溶液、20 μL 0.5 U／mL α-葡萄糖苷酶，振蕩混勻，37 ℃孵育15 min；加入20 μL 2.5 mmol／L PNPG 繼續(xù)孵育15 min，加入80 μL 0.2 mol／L 碳酸鈉終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀上于405 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，每個(gè)質(zhì)量濃度平行3 份，作為樣品組；以等體積PBS 緩沖液代替α-葡萄糖苷酶溶液，作為樣品對(duì)照組；以等體積PBS 緩沖液代替樣品、α-葡萄糖苷酶溶液，作為空白組；其余同“2.2.2”項(xiàng)分組，按“2.2.2” 項(xiàng)下公式計(jì)算抑制率及IC50值，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 α-葡萄糖苷酶雙變量相關(guān)分析、色譜峰篩選、IC50值、主成分評(píng)分Tab.4 Bivariate correlation analysis，chromatographic peak screening，IC50 values and principal component scores for α-glucosidase

2.2.4 結(jié)果分析 由表3～4 可知，樣品對(duì)α-淀粉酶有一定抑制作用，但弱于阿卡波糖，而在抑制α-葡萄糖苷酶活性方面與阿卡波糖相當(dāng)，甚至更優(yōu)；對(duì)2 種酶活性的抑制效果與產(chǎn)地呈現(xiàn)一定相關(guān)性，其中河北、遼寧產(chǎn)樣品優(yōu)于山東、山西產(chǎn)樣品。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

2.3.1 雙變量相關(guān)分析 以23 個(gè)共有峰峰面積及α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的IC50值為原始數(shù)據(jù)，導(dǎo)入SPSS 21.0 軟件中進(jìn)行雙變量相關(guān)分析，分別篩選出與抑制α-淀粉酶活性顯著相關(guān)（P＜0.05），并符合KMO 檢驗(yàn)（KMO＞0.5）、Bartlett 球形檢驗(yàn)（P＜0.05）的13 個(gè)色譜峰，作為α-淀粉酶組；與抑制α-葡萄糖苷酶活性顯著相關(guān)，并符合相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的14 個(gè)色譜峰，作為α-葡萄糖苷酶組，結(jié)果見(jiàn)表3～4。

2.3.2 熱圖繪制 將色譜峰峰面積導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0 平臺(tái)（https：／ ／www.metaboanalyst.ca／），選擇“Statistical Analysis” 模塊，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選、歸一化等操作，輸出熱圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知，2 個(gè)熱圖結(jié)果具有相似性，并呈現(xiàn)一定聚類特征，整體上可分為3 類，河北、遼寧產(chǎn)樣品在成分含量上相似性較高，可聚為一類；山西、山東產(chǎn)樣品與河北、遼寧產(chǎn)樣品在成分含量上具有較大差異，分別聚為一類。

圖3 樣品熱圖Fig.3 Heat maps of samples

2.3.3 主成分分析 采用SPSS 21.0 軟件對(duì)色譜峰進(jìn)行KMO 檢驗(yàn)、Bartlett 球形檢驗(yàn)，其中α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶KMO 度量值分別為0.789、0.642，Bartlett 球形檢驗(yàn)P值均小于0.001，提示各變量間存在顯著相關(guān)性，可進(jìn)行主成分分析。按照對(duì)應(yīng)特征值＞1 的原則提取主成分，α-淀粉酶提取1 個(gè)主成分，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)85.886%；α-葡萄糖苷酶提取2 個(gè)主成分，第一主成分特征值為10.549，貢獻(xiàn)率為75.353%，而第二主成分特征值為1.657，貢獻(xiàn)率為11.834%，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)87.187%。結(jié)合初始因子載荷矩陣（表5）及公式Fi＝A×ZX（A為特征向量矩陣，ZX 為標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)矩陣）計(jì)算主成分得分，再結(jié)合各成分貢獻(xiàn)率建立評(píng)分模型，分別為Fα-淀粉酶組＝0.859 ×F1、Fα-葡萄糖苷酶組＝0.753×F1＋0.118×F2，并進(jìn)行排序，結(jié)果見(jiàn)表3～4。由此可知，2 種酶主成分評(píng)分排序一致，均以河北、遼寧產(chǎn)樣品較高，排名靠前；山東、山西產(chǎn)樣品較低，排名靠后。

表5 初始因子載荷矩陣Tab.5 Loading matrices for initial factors

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相組成進(jìn)行考察，主要關(guān)注有機(jī)相乙腈，因其分離度不好，故加入不同比例的四氫呋喃以使分離度得到改善，同時(shí)峰形不理想，故又加入一定比例的甲酸得以改善。最終確定，最優(yōu)流動(dòng)相為水（含0.1%甲酸）-［乙腈-四氫呋喃-甲酸（120∶10∶0.1）］，此時(shí)各成分分離效果最好，并且可改善前期由于流動(dòng)相混合不充分導(dǎo)致的色譜峰前延問(wèn)題。

由表3～4 可知，山楂葉對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用顯著優(yōu)于α-淀粉酶，峰1、2、4、5（綠原酸）、7、9、11、18（牡荊素鼠李糖苷）、21（蘆?。┡c抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性均具有顯著相關(guān)性，并且α-葡萄糖苷酶相關(guān)性系數(shù)普遍高于α-淀粉酶。另外，5 號(hào)峰（綠原酸）、16 號(hào)峰（牡荊素葡萄糖苷）、18 號(hào)峰（牡荊素鼠李糖苷）、19 號(hào)峰（牡荊素）、21 號(hào)峰（蘆?。?、22 號(hào)峰（金絲桃苷）、23 號(hào)峰（異槲皮素）與抑制α-葡萄糖苷酶活性均顯著相關(guān)，并且大多存在單糖、寡糖結(jié)構(gòu)，具有α-葡萄糖苷酶抑制劑化學(xué)結(jié)構(gòu)特征［11-12］，可能是山楂葉抑制α-葡萄糖苷酶活性優(yōu)于α-淀粉酶的原因。

河北、遼寧產(chǎn)山楂葉對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果略高于山東、山西產(chǎn)，其原因可能與經(jīng)緯度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中15 批樣品采收于河北承德、遼寧葫蘆島、山東臨沂、山西運(yùn)城，其中河北承德樣品采自北緯40°29′57″、東經(jīng)117°26′38″；遼寧葫蘆島樣品與其接近，為北緯40°37′10″、東經(jīng)119°40′22″；山東臨沂、山西運(yùn)城樣品經(jīng)緯度相近，分別為北緯35°27′2″、東經(jīng)117°59′10″及北緯35°20′58″、東經(jīng)111°10′38″。體外降糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山楂葉分組趨勢(shì)與緯度信息有較高的相關(guān)性，并且其產(chǎn)地的海拔、日照時(shí)間、氣溫、降水量等因素可能會(huì)影響黃酮含量，進(jìn)而影響體外降糖試驗(yàn)結(jié)果。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)山楂葉對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用及其UPLC 指紋圖譜的共有峰數(shù)據(jù)進(jìn)行雙變量相關(guān)分析，采用主成分分析進(jìn)行綜合評(píng)分，發(fā)現(xiàn)所得結(jié)果與體外降糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證，表明該方法科學(xué)可靠，可用于山楂葉產(chǎn)地區(qū)分、體外降糖效果評(píng)價(jià)，也能為今后全面評(píng)價(jià)該藥材質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支持及方法參考。