王軍民,孔麗宇,黃月昌,丁思宇,韓麗琴*
(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院,吉林 吉林 132011; 2.吉林醫(yī)藥學(xué)院,吉林 吉林 132013)
參松養(yǎng)心膠囊是以《黃帝內(nèi)經(jīng)》 絡(luò)病學(xué)理論為基礎(chǔ),用以治療心律失常等心血管類疾病的中成藥[1],主要由人參、麥冬、山茱萸、丹參等藥材組成,具有通絡(luò)疏血、清心安神功效[2],與傳統(tǒng)西藥聯(lián)用療效更佳[3],并且副作用?。?]。目前,關(guān)于參松養(yǎng)心膠囊的研究大多是臨床病例方面[5-8],而對其化學(xué)成分、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)鮮有關(guān)注[9-13]。
前期報道,毛蕊異黃酮具有保護(hù)心腦血管的作用[14];槲皮素在治療心血管疾病方面具有重要作用[15];芍藥苷具有抗心肌缺血的作用,在治療老年慢性呼吸道疾病過程中也能發(fā)揮出良好效果[16];阿魏酸可減少血小板5-羥色胺釋放[17],廣泛應(yīng)用于治療心腦血管疾病,并且上述成分也是參松養(yǎng)心膠囊主要活性物質(zhì)。因此,本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時測定參松養(yǎng)心膠囊中綠原酸、芍藥苷、阿魏酸、槲皮素、毛蕊異黃酮的含量,以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。
1.1 藥物 參松養(yǎng)心膠囊共2 批,批號分別為Z20030058、Z20103032,購自北京以嶺藥業(yè)有限公司。
1.2 儀器 LC-20HT 高效液相色譜儀、SPDM20A 電二極管陣列紫外可見光檢測器(230 V)(日本島津公司);CPA225D 型電子分析天平(德國賽多利斯公司)。
1.3 試劑 阿魏酸(批號B20007,純度98%)、芍藥苷(批號B21148,純度95%)、毛蕊異黃酮(批號B20847,純度98%)、槲皮素(批號B20527,純度98%)、綠原酸(批號B20782,純度96%)對照品均購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈為色譜純[賽默飛世爾科技(中國)有限公司];磷酸為色譜純(遼寧泉瑞試劑有限公司);其余試劑均為分析純。
2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相乙腈(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脫,程序見表1;體積流量1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長238 nm;進(jìn)樣量20 μL。
表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs
2.2 溶液制備
2.2.1 對照品溶液 精密稱取槲皮素、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮、綠原酸對照品各1 mg,置于5 mL 量瓶中,少量甲醇超聲溶解后定容,即得(質(zhì)量濃度分別為10、25、4、50、100、200 μg/mL)。
2.2.2 供試品溶液 精密稱取本品內(nèi)容物0.406 5 g,置于磨口錐形瓶中,加入10 mL 甲醇,密塞,稱定質(zhì)量,在25 ℃下超聲(100 Hz、500 W)處理30 min,冷卻至室溫,甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,12 000 r/min離心5 min,取上清液,即得。
2.3 方法學(xué)考察
2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取對照品、供試品溶液適量,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,結(jié)果見圖1。由此可知,各成分分離度均大于1.5,表明該方法系統(tǒng)適用性良好。
圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents
2.3.2 線性關(guān)系考察 取“2.2.1” 項(xiàng)下對照品溶液適量,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸,結(jié)果見表2,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents
2.3.3 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液適量,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次,測得綠原酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮、槲皮素峰面積RSD 分別為1.27%、2.74%、2.31%、2.03%、2.44%,表示儀器精密度良好。
2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液6 份,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,測得綠原酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮、槲皮素峰面積RSD 分別為1.83%、2.68%、2.08%、2.70%、2.49%,表明該方法重復(fù)性良好。
2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液,于0、2、4、6、8、10、12 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣20 μL 測定,測得綠原酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮、槲皮素峰面積RSD 分別為0.80%、2.04%、1.27%、1.01%、2.91%,表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取本品(批號Z20103032)6 份,每份約0.2 g,精密稱定,加入適量對照品溶液,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,計(jì)算回收率。結(jié)果,綠原酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮、槲皮素平均加樣回收率分別為95.48%、99.06%、96.92%、95.00%、96.75%,RSD 分別為0.81%、0.47%、1.40%、2.22%、1.72%。
2.3.7 樣品含量測定 取2 批樣品,按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,計(jì)算含量,結(jié)果見表3。
表3 各成分含量測定結(jié)果(mg/g, n=6)Tab.3 Result of content determination of various constituents(mg/g, n=6)
3.1 檢測波長選擇 本實(shí)驗(yàn)采用光電二極管陣列紫外可見光檢測器,在210~400 nm 波長處進(jìn)行掃描。結(jié)果,毛蕊異黃酮在254、230 nm,芍藥苷在238 nm,槲皮素、綠原酸在220、334 nm,阿魏酸在322 nm 處均有最大吸收。為了保證各成分均有適宜的靈敏度[18]并減少干擾,最終選擇238 nm 作為檢測波長。
3.2 供試品溶液制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑50%、75%、90% 甲醇及無水甲醇,發(fā)現(xiàn)90%甲醇提取效果最佳。再考察了超聲時間20、30、40、60 min,發(fā)現(xiàn)在40 min 時各成分提取率最高。
3.3 流動相比例選擇 本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-0.1% 磷酸作為流動相,考察乙腈不同初始體積分?jǐn)?shù)(19%、27%、40%)對分離效果的影響,發(fā)現(xiàn)在19%時綠原酸、芍藥苷、阿魏酸分離效果較差,尤其是綠原酸、芍藥苷,兩者色譜峰分離度小于1.5,而且其出峰時間均在5 min 內(nèi),容易與溶劑雜質(zhì)峰重合。最終,選擇乙腈初始體積分?jǐn)?shù)為10%并梯度洗脫(10%、19%、25%、28%),此時該成分色譜峰分離度良好。
本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時測定參松養(yǎng)心膠囊中阿魏酸、芍藥苷、槲皮素、綠原酸、毛蕊異黃酮的含量,該方法操作簡便,重復(fù)性、穩(wěn)定性良好,可用于該制劑的質(zhì)量控制。