龍憲偉 劉 洪 菅志遠(yuǎn)

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1 胃腸外科，2 肝膽外科，廣西桂林市 541001)

胰腺導(dǎo)管腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率和病死率均呈逐年上升的趨勢(shì)[1-2]。胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素、多基因共同參與的過程[3]，目前其分子機(jī)制尚未完全清楚。近年來，隨著生物信息技術(shù)的快速發(fā)展，有研究表明多種基因的差異表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌密切相關(guān)[4]。程序性細(xì)胞死亡分子(programmed cell death,PDCD)10位于3號(hào)染色體(3q26.1)上，由212個(gè)氨基酸組成[5]。研究表明，PDCD10基因的差異表達(dá)與多種疾病的病理生理過程密切相關(guān)，包括肝癌[6]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[7]、卵巢癌[8]、腦血管疾病[9-10]、肺癌[11]、胃癌[12]等。但目前關(guān)于PDCD10基因在胰腺導(dǎo)管腺癌中的作用機(jī)制尚未完全明確。本文通過生物信息學(xué)方法分析PDCD10基因在胰腺導(dǎo)管腺癌患者中的表達(dá)水平及其與患者預(yù)后的相關(guān)性，旨在為胰腺導(dǎo)管腺癌的診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析 GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia2.cancer-pku.cn)是基于TCGA數(shù)據(jù)庫和GTEx數(shù)據(jù)庫的信息，用于差異表達(dá)分析、輪廓圖繪制、患者生存分析、相似基因檢測(cè)的在線工具，本研究利用其分析PDCD10基因在胰腺導(dǎo)管腺癌組織和正常胰腺組織中表達(dá)水平的差異，以及與胰腺導(dǎo)管腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1.1.1 PDCD10基因在胰腺導(dǎo)管腺癌組織和正常胰腺組織中的表達(dá)差異分析：選擇“Expression Analysis”中的“Expression DIY”，再選擇“Box Plot”，然后在“Gene”中輸入PDCD10，在“|log2FC|Cutoff”中輸入2，在“p-value Cutoff”中輸入0.001，設(shè)定“Cancer name”為“PAAD”，選擇“Match TCGA normal and GTEx data”，其他為默認(rèn)選項(xiàng)。

1.1.2 PDCD10基因表達(dá)水平與胰腺導(dǎo)管腺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系分析：選擇“Expression Analysis”中的“Survival Analysis”。分析總體生存率時(shí)，在“Gene”中輸入PDCD10，設(shè)定“Methods”為“Overall Survival”在“Cutoff-High(%)”和“Cutoff-Low(%)”中均輸入50，設(shè)定“Cancer name”為“PAAD”，設(shè)定“Axis Units”為“Months”，其他為默認(rèn)選項(xiàng)。分析無病生存率時(shí)，設(shè)定 “Methods”為“Disease Free Survival(RFS)”，其他參數(shù)同上。

1.2 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析 UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)是主要基于TCGA數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)癌癥數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的在線工具，本研究利用其分析PDCD10基因在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的甲基化水平。設(shè)定“Enter gene symbol(s)”為PDCD10，選擇“TCGA”為“dataset Pancreatic Adenocarcinoma”，再選擇“Methylation”。

1.3 LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫分析 LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(http://www.linkedomics.org)是一個(gè)多組學(xué)數(shù)據(jù)庫，本研究利用其分析PDCD10基因在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的共表達(dá)基因，并對(duì)共表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。

1.3.1 PDCD10基因在胰腺導(dǎo)管腺癌病灶組織中的共表達(dá)基因分析：在LinkFinder模塊中，設(shè)定“Select cancer cohort”為“PAAD”，設(shè)定“Select search dataset:Data type”為“RNA seq”， 在“Select sample dataset”中輸入No input， 在“Select search dataset attribute”中輸入PDCD10，設(shè)定“Select target dataset:Data type”為“RNAseq”選擇“Select statistical method”為“Pearson Correlation test”。

1.3.2 PDCD10基因的富集分析：選擇“Select LinkInterpreter”，設(shè)定“Select tool”為“Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)”，選擇“Enrichment Analysis”為“GO Analysis or KEGG”，然后點(diǎn)擊“Select Submit Query”。

1.4 STRING網(wǎng)站分析 通過STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)構(gòu)建PDCD10基因的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，設(shè)定“protein name”為PDCD10，“Organism”為Homo sapiens。

1.5 TIMER數(shù)據(jù)庫分析 在TIMER數(shù)據(jù)庫(http://timer.comp-genomics.org/)，設(shè)定“Gene Expression”為PDCD10，分析PDCD10基因表達(dá)水平與胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞純度、各類型免疫細(xì)胞(CD8+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞)浸潤水平的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 PDCD10基因在胰腺導(dǎo)管腺癌病灶組織和正常胰腺組織中的表達(dá)差異 GEPIA數(shù)據(jù)庫的泛癌分析及PDCD10基因表達(dá)情況箱式圖提示PDCD10在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中呈高表達(dá)水平， PDCD10基因在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)水平高于正常胰腺組織(P<0.05)。見圖1。

圖1 PDCD10基因在胰腺導(dǎo)管腺癌病灶組織和正常胰腺組織中的表達(dá)差異

2.2 PDCD10基因表達(dá)水平與胰腺導(dǎo)管腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 病灶組織中PDCD10基因低表達(dá)水平的胰腺導(dǎo)管腺癌患者的總體生存率及無病生存率均高于病灶組織中PDCD10基因高表達(dá)水平的患者(均P<0.05)。見圖2。

圖2 病灶組織中不同PDCD10基因表達(dá)水平的胰腺導(dǎo)管腺癌患者的生存曲線

2.3 PDCD10基因在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的甲基化水平 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，PDCD10基因在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的甲基化水平升高(P<0.05)。見圖3。

圖3 PDCD10基因在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的甲基化水平

2.4 胰腺導(dǎo)管腺癌組織中PDCD10基因的共表達(dá)基因、功能及通路富集分析結(jié)果 在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中，共有19 774個(gè)基因與PDCD10基因具有相關(guān)性，即共表達(dá)(見圖4A)，與PDCD10基因呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的前50個(gè)基因的熱圖見圖4B、圖4C。進(jìn)一步對(duì)與PDCD10共表達(dá)的基因進(jìn)行KEGG分析和GO富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示：與PDCD10基因共表達(dá)的基因的分子功能以細(xì)胞黏附分子結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、谷氨酸受體結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合、谷氨酸受體活性等為主；生物學(xué)過程以染色體分離、染色體定位、皮膚發(fā)育、ERBB信號(hào)通路、白細(xì)胞凋亡過程、GABA能神經(jīng)肌肉過程、多細(xì)胞生物信號(hào)傳導(dǎo)、突觸傳遞、谷氨酸受體信號(hào)通路等為主；細(xì)胞組成以濃縮染色體、脫氧核糖核酸損傷部位、參與細(xì)胞黏附的蛋白質(zhì)復(fù)合物等為主。KEGG通路分析結(jié)果顯示：與PDCD10基因共表達(dá)的基因主要涉及免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)信號(hào)通路、ERBB信號(hào)通路、谷氨酸受體信號(hào)通路。見圖5。

圖4 在胰腺癌中與PDCD10基因具有相關(guān)性的基因火山圖及正負(fù)相關(guān)基因熱圖

圖5 與PDCD10基因共表達(dá)的基因的GO功能和KEGG通路富集分析

2.5 PDCD10基因的PPI網(wǎng)絡(luò) 在PPI網(wǎng)絡(luò)中，與PDCD10基因編碼蛋白相互作用的主要蛋白有STRN4、SLMAP、STRIP1、STK24、SIKE1、STRN、FGFR1OP2、CCM2、MST4、STK25等(Degree值均>0.4)。見圖6。

圖6 PDCD10基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 PDCD10基因表達(dá)水平與胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞純度、各類型免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性 PDCD10基因表達(dá)水平與胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞純度無相關(guān)性(r=-0.026，P=0.734)，與CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.186，P=0.015)，與CD8+T淋巴細(xì)胞(r=0.362，P<0.001)、B淋巴細(xì)胞(r=0.334，P<0.001)、中性粒細(xì)胞(r=0.364，P<0.001)、巨噬細(xì)胞(r=0.232，P<0.001)、樹突狀細(xì)胞(r=0.392，P<0.001)浸潤水平均呈正相關(guān)。見圖7。

圖7 PDCD10基因表達(dá)水平與胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞純度、各類型免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性

3 討 論

胰腺癌是一種具有高度侵襲性且致死率較高的消化道腫瘤，其中以胰腺導(dǎo)管腺癌最為常見。研究表明，胰腺癌患者的5年生存率不足8%，我國過去10年中胰腺癌導(dǎo)致的死亡病例在癌癥相關(guān)死亡病例中占比增加了9%[13]。由于目前缺乏早期診斷胰腺癌的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，大多數(shù)患者就診時(shí)腫瘤已處于晚期，治療手段有限，且效果未達(dá)理想狀態(tài)，患者的復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率較高[14-16]。因此，亟待進(jìn)一步明確胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，以探尋更為有效的診斷和治療手段。

PDCD基因家族成員高度保守，除了與細(xì)胞程序性死亡有關(guān)，還與發(fā)育障礙、免疫疾病、癌癥等有關(guān)[17]。PDCD10基因最初被確定為凋亡相關(guān)基因[18]。研究表明，PDCD10廣泛表達(dá)于各種類型細(xì)胞，如星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等，在許多生理和病理生理過程中起著重要作用，包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生[19-20]、化療耐藥[21]和神經(jīng)元細(xì)胞遷移[22-23]等。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)細(xì)胞瘤中過表達(dá)PDCD10會(huì)招募和激活小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。Fu等[24]發(fā)現(xiàn)，PDCD10與前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移有關(guān)。由此可見，PDCD10與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本文運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌的多個(gè)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。應(yīng)用 GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，PDCD10基因在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)水平高于正常胰腺組織，病灶組織中PDCD10基因低表達(dá)水平的胰腺導(dǎo)管腺癌患者的總體生存率及無病生存率高于病灶組織中PDCD10基因高表達(dá)水平的患者(均P<0.05)，這表明 PDCD10基因可能是胰腺導(dǎo)管腺癌診斷及預(yù)后評(píng)估的潛在分子標(biāo)志物。為了解PDCD10基因在胰腺導(dǎo)管腺癌中的調(diào)控機(jī)制，本研究基于LinkedOmics數(shù)據(jù)庫對(duì)與PDCD10基因共表達(dá)的基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析結(jié)果顯示，與PDCD10基因共表達(dá)的基因主要參與染色體分離及定位、皮膚發(fā)育、多細(xì)胞生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、突觸傳遞、GABA能神經(jīng)肌肉過程等；KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，與PDCD10基因共表達(dá)的基因主要通過免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)信號(hào)通路、ERBB信號(hào)通路、谷氨酸受體信號(hào)通路參與胰腺癌的發(fā)生。因此推測(cè)PDCD10基因可能通過上述生物學(xué)過程及信號(hào)通路來介導(dǎo)胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生和發(fā)展。甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要研究內(nèi)容，基因的甲基化水平是評(píng)價(jià)惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要標(biāo)志物[25]。本研究結(jié)果顯示，PDCD10基因在胰腺導(dǎo)管腺癌病灶組織中的甲基化水平升高(P<0.05)，這提示胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生和發(fā)展有可能受PDCD10基因甲基化水平的影響，但具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步證實(shí)。

腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞所處的內(nèi)外環(huán)境密切相關(guān)，免疫微環(huán)境影響著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[26]。CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤作用[27]。本研究結(jié)果顯示，PDCD10基因表達(dá)水平與CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤水平呈負(fù)相關(guān)，與CD8+T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤水平均呈正相關(guān)(均P<0.05)，這或可為研究胰腺導(dǎo)管腺癌患者的免疫治療提供新思路。此外，本研究的PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，PDCD10基因編碼的蛋白具有較多的相互作用蛋白，PDCD10基因編碼的蛋白可能與這些蛋白相互作用參與胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，PDCD10基因在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的生存預(yù)后密切相關(guān)，胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生和發(fā)展可能與PDCD10基因甲基化水平有關(guān)。PDCD10基因或可成為胰腺導(dǎo)管腺癌診斷及預(yù)后評(píng)估的潛在分子標(biāo)志物，這為胰腺導(dǎo)管腺癌的免疫治療提供一定的理論基礎(chǔ)。