余方方 吳艷秋 黃 翠 李定富

(海南西部中心醫(yī)院檢驗科， 海南省儋州市 571700)

因多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者的骨髓漿細胞具有克隆性異常增生的特點，患者化療后易發(fā)生免疫功能紊亂，病死風險增加[1]。免疫細胞是指參與機體免疫應答或與免疫應答相關的細胞，主要包括Th17、調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(regulatory T lymphocyte，Treg)、中性粒細胞、淋巴細胞等[2]。Th17與Treg比值(Th17/Treg)主要受Th17、Treg水平變化的影響，兩者可調(diào)控機體的免疫應答[3]。中性粒細胞與淋巴細胞比值(neutrophils-to-lymphocytes ratio，NLR)主要受中性粒細胞、淋巴細胞計數(shù)的影響，其能夠反映機體的免疫功能[4]。研究表明，腫瘤組織可分泌白細胞介素1及腫瘤壞死因子，使中性粒細胞過表達，而中性粒細胞過表達可改變腫瘤組織的生長環(huán)境，利于腫瘤生長[5]。由此推測，免疫細胞異常表達可能對接受化療的MM患者的預后產(chǎn)生影響。因此，本研究分析MM患者化療后近期病死的影響因素，探討Th17/Treg及NLR對MM患者化療后近期病死風險的預測價值，為早期評估MM患者化療后病死風險并及時進行干預提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月至2019年1月在我院接受化療的51例MM患者作為研究對象，其中男性29例、女性22例，年齡45～62(54.63±3.51)歲，成熟漿細胞23例、原幼漿細胞28例。納入標準：(1)符合《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2015年修訂)》[6]中MM的診斷標準，均為初診患者；(2)接受PAD方案(硼替佐米+地塞米松+阿霉素)化療，每4周為1個療程，共3個療程；(3)既往無放化療史；(4)無高血壓、糖尿病等基礎疾病。排除標準：伴重要臟器疾病、嚴重傳染性疾病或感染性疾病、免疫系統(tǒng)性疾病、凝血功能障礙、其他惡性腫瘤及因其他疾病或意外死亡的患者。所有患者及家屬均對本研究知情同意，本研究已通過我院醫(yī)學倫理委員會審批。

1.2 研究方法

1.2.1 收集患者的一般臨床資料：收集患者年齡、性別、骨髓活檢結(jié)果、溶骨性損害情況、確診MM至接受化療時間、MM亞型等資料。

1.2.2 血液生化指標的檢測：(1)于患者首次化療當天，抽取患者空腹外周靜脈血9 mL。取5 mL靜脈血以3 000 r/min離心15 min(離心半徑為10 cm)分離血清，使用全自動生化分析儀(桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司，型號：CA-800C)檢測血清鈣水平，采用相應ELISA試劑盒檢測血清缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α；上海撫生實業(yè)有限公司，批號：FS15692)、程序性死亡配體 1(programmed death ligand 1，PD-L1；上海江萊生物科技有限公司，批號：JL47442)水平；取剩余4 mL靜脈血，使用全自動血細胞分析儀(南京貝登醫(yī)療股份有限公司，型號：BC-5000)檢測患者的血紅蛋白水平、中性粒細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)，并計算NLR。血清鈣正常值為2.25～2.75 mmol/L，血清HIF-1α正常值為(23.15±6.69)ng/L，血清PD-L1正常值為0.06～6.06 ng/mL，血紅蛋白正常值為男性120～160 g/L、女性110～150 g/L，NLR正常值為0.8～1.2。(2)于MM患者首次化療當天，抽取患者空腹靜脈血6 mL存放于含有枸櫞酸鈉抗凝液試管，加入等體積Hank′s液稀釋后取1 mL淋巴細胞分離液，室溫下以1 500 r/min離心15 min，用毛細吸管吸出單個核細胞層后加入5 mL的Hank′s液充分混勻，以1 500 r/min離心10 min后棄上清液再次清洗。使用流式細胞儀(湖南層浪生物科技有限公司，型號：MateCyte 2L6C)檢測Th17和Treg水平，并計算Th17/Treg。Th17/Treg的正常范圍為1.81～8.08。

1.2.3 近期預后評估：MM患者于3個化療療程結(jié)束后接受為期1年的隨訪。觀察并記錄全部患者隨訪期間因MM病情惡化的病死情況，將病死患者納入病死組，其余患者納入生存組。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布的計量資料以[M(P25，P75)]表示，組間比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗；采用Pearson檢驗分析檢測外周血Th17/Treg與NLR的相關性；采用多因素Logistic回歸模型分析MM患者化療后1年內(nèi)病死的影響因素；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析外周血Th17/Treg、NLR預測MM患者化療后1年內(nèi)病死的效能。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 病死組與生存組一般臨床資料及血液生化指標的比較 在隨訪期間，51例MM患者中共10例患者因MM病情惡化死亡(19.61%)。病死組與生存組患者的年齡、性別、骨髓活檢結(jié)果、溶骨性損害發(fā)生情況、MM亞型、確診至接受化療時間、血紅蛋白水平及血清鈣水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；病死組患者血清HIF-1α、PD-L1水平，以及外周血Th17/Treg、NLR均高于生存組(均P<0.05)。見表1。

表1 病死組與生存組一般臨床資料及血液生化指標的比較

2.2 MM患者化療后病死的影響因素 將MM患者化療后1年內(nèi)病死情況設為因變量(1=病死，0=生存)，將2.1中有統(tǒng)計學意義的指標設為自變量(均為連續(xù)變量)，納入多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，血清HIF-1α、PD-L1水平，以及外周血Th17/Treg、NLR均是MM患者化療后1年內(nèi)病死的影響因素(均P<0.05)。見表2。

表2 多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.3 外周血Th17/Treg和NLR預測MM患者化療后1年內(nèi)病死的效能 以MM患者化療預后作為狀態(tài)變量(“1”=病死；“0”=存活)，以Th17/Treg、NLR作為檢驗變量，繪制ROC曲線。結(jié)果顯示，外周血Th17/Treg、NLR單獨及二者聯(lián)合預測MM患者化療后1年內(nèi)病死風險的曲線下面積分別為0.755、0.737、0.818，均有良好的預測效能，以二者聯(lián)合預測效能最高。見表3、圖1。

表3 各指標預測MM患者化療后病死風險的效能分析

圖1 外周血Th17/Treg、NLR單獨及聯(lián)合預測MM患者化療后1年內(nèi)病死的ROC曲線圖

2.4 MM患者外周血Th17/Treg與NLR的相關性 相關性分析結(jié)果顯示，MM患者外周血Th17/Treg與NLR呈正相關(r=0.374，P=0.007)。

3 討 論

MM在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中較為常見，既往主要使用硼替佐米治療，但效果不盡人意[7]。目前臨床上多采用PAD方案治療MM，多數(shù)患者的治療效果良好，但部分MM患者免疫功能異常，化療后病情仍有惡化趨勢，從而出現(xiàn)不良預后[8]。梁賾隱等[9]發(fā)現(xiàn)，約有20%MM患者(接受硼替佐米為基礎的化療方案治療)在化療開始后1年內(nèi)死亡。本研究結(jié)果顯示，51例經(jīng)PAD方案化療的MM患者1年內(nèi)的病死率為19.61%，與上述研究結(jié)果相似，這提示MM患者化療后1年內(nèi)病死率較高。研究表明，缺氧、協(xié)同刺激因子在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著關鍵性作用[10]。HIF-1α可增加腫瘤細胞的侵襲性，增加腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的風險[11]。腫瘤細胞快速增殖導致需氧量增加，局部氧氣彌散減少導致腫瘤細胞處于低氧微環(huán)境，低氧狀態(tài)下HIF-1α可不斷刺激內(nèi)皮細胞增生，為腫瘤細胞的血供和氧氣需求提供有利條件，這是腫瘤細胞增殖的重要機制[12]。作為主要的協(xié)同刺激因子，PD-L1通常在活化B淋巴細胞、T淋巴細胞等細胞中表達，研究表明，PD-L1在乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤患者，甚至部分血液系統(tǒng)惡性疾病患者中呈過表達[13]。本研究結(jié)果顯示，病死組血清HIF-1α、PD-L1水平均高于生存組，且血清HIF-1α、PD-L1水平均是MM患者化療后1年內(nèi)病死的影響因素(均P<0.05)。這可能是因為PD-L1能夠向T淋巴細胞傳遞抑制信號，使得T淋巴細胞活性減弱，造成腫瘤免疫抑制，機體抗腫瘤能力減弱，從而導致腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸[14]。因此，MM患者化療后機體免疫抑制狀況可增加腫瘤復發(fā)風險，導致病情惡化，增加病死風險。

研究表明，Th17可釋放白細胞介素、腫瘤壞死因子等多種炎癥因子，加速炎癥反應的發(fā)生，進一步加重腫瘤患者的病情[15]，而Treg可調(diào)節(jié)機體抗炎因子與促炎因子之間的平衡[16]。中性粒細胞是反映機體炎癥反應的主要指標之一，中性粒細胞升高可直接影響宿主細胞的免疫功能，降低宿主細胞的抗癌能力。同時，中性粒細胞可釋放大量血管內(nèi)皮生長因子，使毛細血管增生，為腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移提供有利條件。淋巴細胞能夠阻止腫瘤細胞增殖及遷移，發(fā)揮抗腫瘤作用[17]；淋巴細胞減少可降低機體的抗腫瘤能力，且淋巴細胞與機體免疫反應密切相關[18]。相比于單獨檢測中性粒細胞或淋巴細胞，NLR更能有效反映機體的炎癥反應程度[19]。因此，本研究檢測MM患者的外周血Th17/Treg及NLR，結(jié)果顯示，病死組患者外周血Th17/Treg、NLR均高于存活組，外周血Th17/Treg、NLR均是MM患者化療后1年內(nèi)病死的影響因素，且MM患者外周血Th17/Treg與NLR呈正相關(均P<0.05)。這表明MM患者的外周血Th17/Treg、NLR相互作用并共同參與MM的疾病進展，兩者升高均提示MM患者有預后不良風險。本研究的ROC曲線結(jié)果顯示，外周血Th17/Treg、NLR單獨及二者聯(lián)合預測MM患者化療后1年內(nèi)病死風險的曲線下面積分別為0.755、0.737、0.818，均有良好的預測效能，以二者聯(lián)合預測效能最高。這提示對于外周血Th17/Treg、NLR均升高的MM患者，應考慮存在化療后病情惡化的可能，須積極做好防治措施。

綜上所述，血清HIF-1α、PD-L1水平升高，以及外周血Th17/Treg、NLR升高的MM患者化療后1年內(nèi)病死的風險增加。外周血Th17/Treg、NLR單獨及二者聯(lián)合對MM患者化療后1年內(nèi)病死均具有良好的預測效能，以二者聯(lián)合預測效能最高。