何姬，劉妍如*，段金廒，唐志書,3，宋忠興，趙艷婷，張德柱，楊國偉

1陜西中醫(yī)藥大學 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，咸陽 712083；2南京中醫(yī)藥大學 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心 江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室,南京 210023；3中國中醫(yī)科學院，北京 100700；4陜西盤龍藥業(yè)集團股份有限公司，商洛 711400；5山西省檢驗檢測中心(山西省標準計量技術(shù)研究院)，太原 030002

盤龍七片來源于中醫(yī)骨傷世家王家成所獻秘方，是由29味中藥組成的復方制劑。臨床上主要用于治療風濕類、腰肌勞損、軟組織損傷所致的疼痛、腫脹等病癥[1,2]。研究表明生物堿是盤龍七片的主要成分之一，通過下調(diào)炎癥因子，調(diào)節(jié)巨噬細胞極化等途徑發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛的作用[3-5]?，F(xiàn)代藥理學結(jié)果顯示部分生物堿類既是有效成分也是毒性成分[6]，如使用不當可導致嚴重的不良反應(yīng)，而目前盤龍七片的質(zhì)量控制標準(《國家中成藥品標準》WS3-B-3998-98-1)未對生物堿含量進行測定[7]。因此，為了提高盤龍七片的質(zhì)量控制水平，保證其臨床用藥的安全性和有效性，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS對盤龍七片中具有抗炎鎮(zhèn)痛作用的生物堿類成分進行表征，然后建立同時測定其含量的定量方法，為提高盤龍七片質(zhì)量控制水平提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Triple TOFTM5600三重四級桿飛行時間質(zhì)譜儀(美國愛博才思公司)；FW-400AD高速萬能粉碎機(天津鑫博得儀器有限公司)；Agilent 1290型高效液相色譜串聯(lián)AB SCIEX4500 Qtrap三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司，美國愛博才思公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Sartorius CPA225D十萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯科學儀器有限公司)。

1.2 材料

對照品別隱品堿(批號MUST-22031111，純度98.12%)；小檗紅堿(批號MUST-21120701，純度98.71%)；次烏頭堿(批號MUST-22032312，純度98.59%)；二氫鹽酸白屈菜紅堿(批號MUST-22032004，純度99.21%)；四氫小檗堿(批號MUST-22030608，純度99.27%)；苯甲酰烏頭原堿(批號MUST-22042014，純度98.26%)；鹽酸鹽酸白屈菜紅堿(批號MUST-21101002，純度99.41%)；鹽酸小檗堿(批號MUST-22010607，純度98.38%)；鹽酸鹽酸血根堿(批號MUST-21062912，純度99.76%)；苯甲酰次烏頭原堿(批號MUST-22030911，純度99.68%)；苯甲酰新烏頭原堿(批號MUST-22031710，純度98.55%)均購自成都曼斯特生物科技有限公司；歐烏頭堿(批號HR2056W1，純度≥98%)；二氫血根堿(批號HR2111W10，純度≥98%)均購自寶雞辰光生物科技有限公司；烏頭堿(批號230001-202105，純度≥98%)；新烏頭堿(批號240007-202104，純度≥98%)均購自上海鴻永生物科技有限公司 ；原阿片堿(批號110853-201805，純度99.6%)購自中國食品藥品鑒定研究所；α-玉柏堿(批號AF21061902，純度≥98%)購自成都埃法生物科技有限公司；無水乙醇(分析級，安徽安特食品股份有限公司)；甲醇(分析級，成都市科隆化學品有限公司)；乙腈(色譜級，德國默克公司)；甲酸(批號：H158A，美國西格瑪奧德里奇公司)；水為超純水(密理博超純水機制備)。樣品為盤龍七片及單味藥材，由陜西盤龍藥業(yè)集團股份有限公司提供(見表1)。

表1 盤龍七片樣品及單味藥材信息Table 1 Panlongqi tablets samples and single flavor medicinal material information

1.3 溶液的制備

1.3.1 對照品溶液的制備

分別稱取對照品適量，加甲醇制成每毫升含苯甲酰次烏頭原堿6.00 μg/mL，小檗堿6.00 μg/mL，二氫白屈菜紅堿2.90 μg/mL，苯甲酰新烏頭原堿9.50 μg/mL，二氫血根堿4.80 μg/mL，歐烏頭堿3.33 μg/mL，鹽酸血根堿2.80 μg/mL，原阿片堿2.90 μg/mL，苯甲酰烏頭原堿8.57 μg/mL，別隱品堿2.40 μg/mL，α-玉柏堿2.70 μg/mL，白屈菜紅堿2.90 μg/mL，四氫小檗堿2.60 μg/mL，次烏頭堿1.67 μg/mL，烏頭堿13.60 μg/mL，新烏頭堿3.00 μg/mL，小檗紅堿1.53 μg/mL的對照品儲備液，于4 ℃保存。分別等量吸取上述對照品儲備液混勻并濃縮3倍作為混合標準品溶液，于4 ℃保存。

1.3.2 供試品溶液的制備

取本品20 片除去包衣，研細，混勻，精密稱取細粉約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超聲25 min(250 W，40 kHz)，放冷至室溫，稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液[7]。

1.3.3 單味藥材樣品的制備

取伸筋草、鐵棒錘、老鼠七、草烏、川烏各0.5 g，精密稱定，按“1.3.2”項下方法制備單味藥材溶液。

1.3.4 陰性樣品的制備

按盤龍七片處方比例及制備工藝分別制備缺伸筋草、缺老鼠七、缺草烏、缺川烏、缺鐵棒錘的陰性樣品，按照“1.3.2”項下方法制備各陰性樣品供試品溶液。

1.4 成分表征條件

1.4.1 色譜條件

采用ACQUITY UPLC?BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱，流動相為0.1%甲酸-水溶液(A)-乙腈溶液(B)，梯度洗脫程序：0～2 min，0.2%→12% B；2～8 min，12%→13% B；8～14 min，13%→30% B；14～24 min，30%→45% B；24～35 min，45%→70% B；35～42 min，70%→90% B；42～46 min，90%→0.2% B；46～50 min，0.2%→0.2% B；柱溫40 ℃；體積流量為0.3 mL/min，進樣量2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源(ESI)，正離子模式下，采用信息依賴采集(IDA)、動態(tài)背景扣除(DBS)和高靈敏度模式采集數(shù)據(jù)。離子掃描范圍m/z100～2 000，正離子模式下源噴射電壓(ion spray voltage floating)為5 500 V，裂解電壓(declustering potential，DP)為80 V，碰撞能量(collision energy，CE)為35 V，正離子模式下，霧化氣(ion source gas 1，GS1)和輔助氣(ion source gas 2，GS2)為氮氣，皆為50 psi，氣簾氣(curtain gas，CUR)為35 psi，霧化溫度(temperature，TEM)550 ℃。

1.5 定量條件

1.5.1 液相條件

同“1.4.1”項。

1.5.2 質(zhì)譜條件

定量質(zhì)譜分析采用ESI正離子模式進行掃描，檢測模式為多反應(yīng)檢測(multiple reaction monitoring,MRM)。離子化參數(shù)為離子噴霧電壓，正離子模式5 500 V；霧化氣和輔助氣為氮氣，皆為50 psi；離子源溫度550 ℃?；衔镫x子對，優(yōu)化后的采集參數(shù)：去簇電壓(declustering potential，DP)、碎裂能量(collision energy，CE)和碰撞池出口電壓(cell exit potential，CXP)等信息見表2。

表2 盤龍七片中17種生物堿類化合物檢測參數(shù)Table 2 LC-MS-MS data for the seventeen alkaloids in PLT

續(xù)表2(Continued Tab.2)

2 結(jié)果

2.1 成分表征

單味藥材、盤龍七片生物堿成分表征正離子模式的總離子流圖見圖1。通過Peakview 2.2 查看采集數(shù)據(jù)，以AB SCIEX master view 1.1.0.0 中藥成分數(shù)據(jù)庫(TCM library 1.0)作為生物堿成分匹配庫。通過比對精確質(zhì)量數(shù)、同位素峰度比以及碎片離子裂解規(guī)律等信息，初步從盤龍七片中表征出17種生物堿成分并做了單味藥材成分歸屬(見表3)。

圖1 單味藥材、盤龍七片生物堿成分表征的正離子模式總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram for the characterization of single herbs and Panlongqi tablets alkaloids composition under positive ion mode 注：A.老鼠七； B.伸筋草；C.鐵棒錘；D.草烏；E.川烏；F.盤龍七片(批號20210329)；1～17的化合物名稱見表3。Note:A.HR;B.LH;C.APR;D.AKR;E.AR;F.PLT (Batch Number 20210329);The compound names of 1-17 are shown in Table 3.

表3 盤龍七片中17種生物堿成分Table 3 Seventeen alkaloids components in the PLT

2.2 定量方法學考察

根據(jù)UPLC-Q-TOF-MS確定的生物堿成分，采用UPLC-ESI-MS/MS對盤龍七片中17種生物堿成分進行定量方法學考察。

2.2.1 專屬性

分別取空白、混合對照品溶液、供試品溶液、缺單味藥材的陰性供試品溶液，按“1.5”項下條件進樣分析，MRM提取離子圖見圖2。除鐵棒錘、草烏、川烏中均含有相似的生物堿成份外，在其他對照品出峰位置上缺單味藥材陰性供試品溶液未見干擾峰，說明單味藥材中的生物堿成分不干擾盤龍七片中化合物的測定。

圖2 空白、混合對照品、供試品溶液、陰性供試品溶液的MRM提取離子圖Fig.2 MRM extraction ion chromatograms of blank,mixed control,test solution and negative test solution注：A.空白；B.17種對照品(名稱見表2)；C.供試品溶液(批號20210329)；D：缺老鼠七單味藥材；E：缺伸筋草單味藥材；F：缺川烏單味藥材；G：缺鐵棒錘單味藥材；H：缺草烏單味藥材。Note:A.Blank;B.Seventeen kinds of controls (the names are shown in Table 2);C.Test solution (batch number 20210329);D:Lack of HR;E:Lack of LH;F:Lack of AR;G:Lack of APR;H:Lack of AKR.

2.2.2 標準曲線、檢出限和定量限

精密吸取“1.3.1”項下混合對照品溶液，加入甲醇按梯度體積稀釋，按照“1.5”項下條件進行測定，記錄色譜圖。以被測化合物濃度(μg/mL)為橫坐標(x)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(y)，繪制標準曲線。

盤龍七片不同化合物的線性范圍為0.26×10-3～28.5 μg/mL，且相關(guān)系數(shù)均大于0.999，表明各對照品線性關(guān)系良好。17種生物堿的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及定量限、檢測限結(jié)果見表4。

表4 17種生物堿同時測定方法線性方程、線性范圍、定量限、檢測限結(jié)果Table 4 Linear equations,linear ranges,quantitative limits,and detection limits of seventeen alkaloids simultaneous determination methods

2.2.3 精密度試驗

取盤龍七片供試品溶液(批號20210329)，按“1.5”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，計算盤龍七片中17種生物堿峰面積的RSD在2.00%～2.95%之間，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

取盤龍七片的供試品溶液(批號20210329)，按“1.5”項下色譜條件分別于制備后0、3、6、9、12、24 h進樣，計算盤龍七片中17種生物堿峰面積的RSD在1.18%～4.48%之間，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復性試驗

取盤龍七片(批號20210329)6份，按“1.3.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“1.5”項下色譜條件進樣，計算盤龍七片中17種生物堿含量的RSD在0.75%～5.65%之間，表明此方法重復性良好。17種生物堿精密度、穩(wěn)定性、重復性結(jié)果見表5。

表5 17種生物堿同時測定方法精密度、穩(wěn)定性、重復性結(jié)果(n = 6)Table 5 Results of precision,stability and repetitive of seventeen simultaneous determination methods of alkaloids (n = 6)

2.2.6 加樣回收率試驗

精密稱取同一供試品(批號20210329)約0.5 g，共6份，置25 mL具塞錐形瓶中，加入各對照品適量，按“1.3.2”項方法制備供試品溶液，在“1.5”項下的色譜條件下進行測定，記錄不同成分相應(yīng)信號強度，計算加樣回收率。各成分的平均回收率和RSD的結(jié)果見表6。

表6 17種生物堿同時測定方法平均加樣回收率及RSD結(jié)果(n = 6)Table 6 Average dosing recovery rate and RSD results of seventeen alkaloids simultaneous determination methods (n = 6)

續(xù)表6(Continued Tab.6)

2.2.7 樣品測定

按“1.5”項的條件，測定并計算8批盤龍七片中17種生物堿成分的含量(μg/g)，結(jié)果見表7。

表7 8個批次盤龍七片中17種生物堿成分的含量Table 7 The content of seventeen alkaloids components in eight batches of PLT(μg/g)

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測條件及供試品溶液制備方法的選擇

綜合考慮生物堿類成分的結(jié)構(gòu)和極性特點，采用MRM掃描模式，正、負離子模式分別檢測，根據(jù)響應(yīng)值及色譜峰的數(shù)量選擇正離子模式檢測。考察了提取方式(超聲、加熱回流)、提取溶劑(無水乙醇、70%甲醇、100%甲醇)對盤龍七片生物堿類成分提取的影響，綜合色譜峰峰型及響應(yīng)值，本研究選擇甲醇超聲提取25 min為盤龍七片中生物堿的提取方法。

3.2 潛在質(zhì)量控制成分指標篩選

生物堿類成分是盤龍七片發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛功效的重要成分之一，其中含量較高的單酯類生物堿苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿由雙酯類生物堿烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿水解得到，在保留其抗炎、抗風濕、治療關(guān)節(jié)炎等藥理作用的同時毒性大大降低。結(jié)合生物堿類指標成分的相關(guān)研究[11,15,16]，本文選擇苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿作為潛在的質(zhì)量指標成分。烏頭堿類生物堿成分水解方式如圖所示[17]，如圖3。

圖3 烏頭堿類生物堿成分水解過程Fig.3 Hydrolysis process of aconitine alkaloid components

3.3 異喹啉生物堿成分含量差異

通過比較8個批次樣品中異喹啉生物堿的成分含量差異，發(fā)現(xiàn)鹽酸血根堿、二氫血根堿、鹽酸白屈菜紅堿、二氫鹽酸白屈菜紅堿、別隱品堿、小檗紅堿、四氫小檗堿、原阿片堿各批次含量較為穩(wěn)定，而鹽酸小檗堿各批次含量差異較大。分析原因可能是小檗堿為季胺堿，在游離狀態(tài)對熱不穩(wěn)定分解成為小檗紅堿，與盤龍七片中的黃酮類等酸性成分結(jié)合生成鹽，造成鹽酸小檗堿含量的變化[18,19]。

盤龍七片是臨床中治療風濕骨痛類疾病的重要藥物，由于其含有毒性生物堿類成分，藥物的安全性更應(yīng)得到重視。故基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)表征出的盤龍七片中17種生物堿成分，本文建立了盤龍七片中生物堿類成分同時測定的液質(zhì)聯(lián)用方法，所建方法準確可靠，可為提升盤龍七片的質(zhì)量控制水平提供基礎(chǔ)。