岳 麗，孫佳瑤，劉龍芳

腦小血管病(CSVD)作為腦內(nèi)微小動(dòng)靜脈受損后引發(fā)的一組疾病，其病理過程主要為炎癥反應(yīng)致腦組織缺氧缺血，與患者年齡密切相關(guān)[1-2]。近年來，隨著人口老齡化的加劇，該病發(fā)病率明顯增長[3]，受到臨床高度關(guān)注?，F(xiàn)階段，我國25%～50%的缺血性腦卒中是因CSVD所致，且CSVD被認(rèn)為是引起認(rèn)知功能障礙的主要原因[4]。由于CSVD導(dǎo)致的血管性認(rèn)知功能障礙通常發(fā)生于疾病早期，且具有可逆性[5-6]，因此，早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)往往可獲得良好預(yù)后。有學(xué)者指出，雌激素對認(rèn)知功能損害具有一定保護(hù)作用[7]，而G蛋白耦聯(lián)受體30(GPR30)作為雌激素受體的非典型受體，在雌激素的急性神經(jīng)保護(hù)作用中發(fā)揮重要作用[8]。研究表明，微炎癥狀態(tài)是認(rèn)知功能損害的危險(xiǎn)因素之一[9]，而血小板與淋巴細(xì)胞比值(PLR)作為新型炎癥反應(yīng)標(biāo)志物，其水平變化與缺血性腦血管病患者病情程度及預(yù)后密切相關(guān)[10]。神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白4(NPAS4)作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在突觸生長發(fā)育調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其水平改變可致突觸調(diào)節(jié)失衡，進(jìn)而引發(fā)認(rèn)知功能損害[11]。因此，本研究分析CSVD患者外周血GPR30、PLR、NPAS4表達(dá)水平與認(rèn)知功能、短期預(yù)后的關(guān)系，以期為今后臨床治療工作提供參考?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2019年1月—2021年2月我院收治的CSVD 200例。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合CSVD相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，并經(jīng)頭顱MRI檢查確診；可自行完成神經(jīng)心理學(xué)檢查；臨床資料詳細(xì)完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：近1個(gè)月內(nèi)有外科手術(shù)史或創(chuàng)傷史，1年內(nèi)有腦出血或腦梗死史者；合并嚴(yán)重肝腎功能障礙或造血系統(tǒng)疾病者；伴有雙相情感障礙或抑郁癥者；合并Alzheimer's、Parkinson's等影響認(rèn)知功能疾病者；臨床資料不全者。依據(jù)是否發(fā)生認(rèn)知功能損害分為發(fā)生組85例和未發(fā)生組115例。認(rèn)知功能障礙采用蒙特利爾認(rèn)知量表(MoCA)進(jìn)行評價(jià)，總分30分，<26分為認(rèn)知功能障礙，≥26分為無認(rèn)知功能障礙[13]。

1.2方法 入院24～72 h內(nèi)，清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，抽取肘靜脈血6 ml，靜置20 min后；一管2 ml以16.5 cm離心半徑、1200 r/min轉(zhuǎn)速離心處理20 min，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)、合成引物序列，以β-actin作為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)，測定GPR30 mRNA表達(dá)水平；一管2 ml以16.5 cm離心半徑、3500 r/min離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行高速離心處理10 min，取上層清液待檢；以上海聯(lián)邁生物工程有限公司提供酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒測定NPAS4表達(dá)水平；一管2 ml采用XN-9000血液分析儀及其配套試劑計(jì)數(shù)血小板及淋巴細(xì)胞，計(jì)算PLR。

1.3觀察指標(biāo) 比較2組臨床資料、外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4表達(dá)水平，分析外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4表達(dá)與CSVD患者認(rèn)知功能損害的關(guān)系，評價(jià)其對CSVD患者認(rèn)知功能損害的診斷價(jià)值，分析外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4表達(dá)對CSVD發(fā)生認(rèn)知功能損害患者短期預(yù)后不良危險(xiǎn)度的關(guān)系。

1.4短期預(yù)后判定標(biāo)準(zhǔn) 參考文獻(xiàn)[14]制定短期預(yù)后判定標(biāo)準(zhǔn)：MoCA評分≤20分者，出院后6個(gè)月評分升高判定為短期預(yù)后良好；MoCA評分>20分者，出院后6個(gè)月評分升高或維持不變判定為短期預(yù)后良好；反之則為短期預(yù)后不良。

2 結(jié)果

2.1臨床資料 2組文化程度、腔隙性腦梗死(LI)病灶數(shù)目、腦白質(zhì)病變(WMLs)評分及腦血管病面積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

2.2外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4表達(dá)水平 發(fā)生組外周血GPR30 mRNA水平低于未發(fā)生組，PLR、NPAS4表達(dá)水平高于未發(fā)生組(P<0.01)。見表2。

表1 2組CSVD臨床資料比較

表2 2組CSVD外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4表達(dá)水平比較

2.3外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4表達(dá)與CSVD患者認(rèn)知功能損害的關(guān)系 以CSVD患者發(fā)生認(rèn)知功能損害與否為因變量(未發(fā)生=0，發(fā)生=1)，將上述差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素作為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析顯示，調(diào)整文化程度、LI病灶數(shù)目、WMLs評分及腦血管病面積等混雜因素后，外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4表達(dá)仍與CSVD患者認(rèn)知功能損害顯著相關(guān)(P<0.01)。見表3。

2.4外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4表達(dá)對CSVD患者認(rèn)知功能損害的診斷價(jià)值 繪制ROC曲線評價(jià)外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4表達(dá)對CSVD患者認(rèn)知功能損害的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4表達(dá)聯(lián)合診斷AUC最大，為0.943(95%CI為0.901,0.971)。見表4，圖1。

表3 外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4表達(dá)與CSVD患者認(rèn)知功能損害的關(guān)系

表4 外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4表達(dá)對CSVD患者認(rèn)知功能損害的診斷價(jià)值

圖1 外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4診斷CSVD患者認(rèn)知功能損害的ROC曲線

2.5外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4表達(dá)與CSVD發(fā)生認(rèn)知功能損害患者短期預(yù)后不良危險(xiǎn)度的關(guān)系 根據(jù)CSVD發(fā)生認(rèn)知功能損害患者外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4表達(dá)平均值，將其分為高表達(dá)亞組(>平均值)與低表達(dá)亞組(≤平均值)，CSVD發(fā)生認(rèn)知功能損害患者外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4高表達(dá)時(shí)，短期預(yù)后不良發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)的0.274、3.949、3.276倍。見表5。

3 討論

CSVD病變位于末梢血管，通過作用于神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化，引起相關(guān)顱腦組織持續(xù)性損傷，最終可造成認(rèn)知功能障礙[15-17]。CSVD作為血管性認(rèn)知功能障礙的重要亞型，患者早期認(rèn)知功能障礙較輕微，具有可逆性，但隨著病情發(fā)展，可引起血管性癡呆[18-19]。

CSVD發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，有學(xué)者認(rèn)為與腦組織神經(jīng)元凋亡有關(guān)[20]。研究表明，雌激素治療有助于改善老年女性認(rèn)知功能，而雌激素通過結(jié)合雌激素受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[21]。GPR30作為一種新型雌激素受體，在腦組織中過度表達(dá)，而G1作為其選擇性激動(dòng)劑，在激動(dòng)GPR30的同時(shí)，不與雌激素其他受體結(jié)合[22]。相關(guān)研究指出，腦缺血性損傷后，G1可抑制腦組織神經(jīng)元凋亡，提示GPR30在腦神經(jīng)保護(hù)中發(fā)揮重要作用[23]。本研究結(jié)果顯示，發(fā)生組外周血GPR30 mRNA表達(dá)水平低于未發(fā)生組，且進(jìn)一步多因素Logistic回歸分析顯示，其表達(dá)水平與CSVD發(fā)生認(rèn)知功能障礙顯著相關(guān)，提示CSVD患者外周血GPR30 mRNA表達(dá)上調(diào)，可能參與認(rèn)知功能損害，分析其具體機(jī)制，可能是由于GPR30通過MAPK/ERK或PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，加速神經(jīng)遞質(zhì)釋放及海馬突觸的可塑性，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)及調(diào)節(jié)作用[24]，且上調(diào)的GPR30通過抑制TLR4/NF-κB炎癥反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低腦損傷后白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等相關(guān)炎性因子釋放，發(fā)揮抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用[25]。

表5 外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4表達(dá)與CSVD發(fā)生認(rèn)知功能損害患者短期預(yù)后不良的關(guān)系

此外，國外學(xué)者指出，抑制性與興奮性神經(jīng)元均可誘導(dǎo)NPAS4等早期應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，從而對其突觸輸入不同調(diào)節(jié)作用，如促進(jìn)抑制性神經(jīng)元興奮、誘導(dǎo)興奮性神經(jīng)元抑制，在維持抑制性與興奮性突觸間保持對運(yùn)動(dòng)的執(zhí)行、感知信息輸出平衡及高級認(rèn)知功能發(fā)揮作用[26]。另有學(xué)者指出，NPAS4參與腦組織缺血過程，缺血性腦卒中發(fā)生后，內(nèi)皮細(xì)胞中NPAS4表達(dá)明顯上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)新生血管形成[27]，而新生血管形成是血管性癡呆的作用機(jī)制之一[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生組外周血NPAS4表達(dá)水平高于未發(fā)生組，且其水平升高參與CSVD患者認(rèn)知功能損害發(fā)生。CSVD患者腦小血管發(fā)生病變后，腦組織缺氧缺血，異常高濃度的興奮性氨基酸大量釋放，致離子內(nèi)流至神經(jīng)元，從而造成神經(jīng)元損傷，而神經(jīng)元損傷可觸發(fā)NPAS4表達(dá)。

CSVD發(fā)病后腦組織迅速缺氧缺血，機(jī)體產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，致腦損傷加劇，當(dāng)炎性介質(zhì)損耗或被阻滯時(shí)，腦損傷面積減小[29]。血小板可合成、釋放多種炎性介質(zhì)，其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在腦組織缺氧缺血中起關(guān)鍵作用，而淋巴細(xì)胞作為機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要參與者，可通過促進(jìn)抗炎因子釋放，下調(diào)促炎因子分泌，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[30]，故PLR可作為一個(gè)炎癥狀態(tài)指標(biāo)[31]。本研究中發(fā)生組外周血PLR表達(dá)水平高于未發(fā)生組，且多因素Logistic回歸分析顯示，其表達(dá)水平與CSVD患者認(rèn)知功能損害發(fā)生顯著相關(guān)，與既往研究觀點(diǎn)相符，提示CSVD發(fā)病后，機(jī)體處于炎癥狀態(tài)，PLR表達(dá)水平明顯上調(diào)，致機(jī)體炎癥反應(yīng)加劇，造成血管性損傷及神經(jīng)退行性病變，增加認(rèn)知功能損傷風(fēng)險(xiǎn)。

本研究ROC曲線分析顯示，外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4表達(dá)聯(lián)合診斷CSVD患者認(rèn)知功能障礙的AUC最大，且>0.9，具有良好的診斷效能，分析原因:可能是由于CSVD患者認(rèn)知功能損害發(fā)病機(jī)制涉及較廣，如腦組織神經(jīng)元凋亡、新生血管形成、微炎癥狀態(tài)等，GPR30、PLR、NPAS4在其發(fā)病過程中參與機(jī)制不同，聯(lián)合診斷更為全面、準(zhǔn)確。此外，本研究中外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4高表達(dá)亞組CSVD認(rèn)知功能障礙患者預(yù)后不良率高于低表達(dá)亞組，且CSVD發(fā)生認(rèn)知功能障礙患者外周血GPR30 mRNA、PLR、NPAS4高表達(dá)時(shí)，短期預(yù)后不良發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)的0.274、3.949、3.276倍，提示GPR30 mRNA、PLR、NPAS4表達(dá)與CSVD發(fā)生認(rèn)知功能障礙患者短期預(yù)后有關(guān)，但本研究樣本量較小，且屬于回顧性研究，還需臨床擴(kuò)大樣本量，作進(jìn)一步前瞻性研究證實(shí)。

綜上所述，CSVD患者外周血GPR30 mRNA表達(dá)下調(diào)，PLR、NPAS4表達(dá)明顯上調(diào)，且其表達(dá)與認(rèn)知功能障礙的發(fā)生及短期預(yù)后有關(guān)，臨床檢測其表達(dá)水平可為認(rèn)知功能障礙的診斷及短期預(yù)后預(yù)測提供客觀支持，為疾病治療方案制定提供依據(jù)。