陳德合，夏天紅，王 杰，郭 剛，杜成周，尚力凝，陳 鵬，李洪濤

腫瘤是全球重大公共衛(wèi)生問題，嚴重威脅著人類生命健康，其中在全球有57個國家(包括中國)腫瘤超過心血管疾病成為導致死亡的第一殺手[1-2]。胃癌是人類消化道發(fā)病率和病死率最高的腫瘤，僅2020年全球新發(fā)胃癌患者108.9萬例，因胃癌死亡達76.9萬例[3]。胃腺癌是胃癌的主要類型，起源于胃最表層或黏膜腺體，約占胃癌90%，發(fā)病原因可能與環(huán)境和遺傳因素有關，但具體發(fā)病機制仍不清楚[4]。因此,尋找診斷、治療和預后判斷的新標志物對胃腺癌精準診療及預后改善尤為重要。隨著生物、醫(yī)學及科技領域的日新月異，蛋白質分子組學、高通量測序及生物信息學技術不斷應用，使得精準診療成為可能。大數(shù)據(jù)時代的到來，公共醫(yī)學數(shù)據(jù)庫不斷涌現(xiàn)，推動了醫(yī)學的快速發(fā)展，進而為腫瘤基礎醫(yī)學和轉化醫(yī)學研究者貢獻了大量基因組數(shù)據(jù)和其關聯(lián)臨床數(shù)據(jù)。本研究欲通過可視化的GEPIA 2.0腫瘤數(shù)據(jù)分析平臺，對TCGA及GTEx中胃腺癌及癌旁組織的差異基因及預后相關基因進行分析，以期發(fā)現(xiàn)胃腺癌新的診斷標志物或潛在的治療靶點。

1 資料與方法

1.1一般資料 利用GEPIA 2.0腫瘤數(shù)據(jù)分析平臺，對TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中408個胃腺癌和211個癌旁組織樣本RNASeq的數(shù)據(jù)進行可視化基因表達動態(tài)分析；運用FunRich(Version 3.1.3)軟件進行GO和KEGG富集分析；接著通過GEPIA 2.0和StarBase v2進行關鍵基因表達與預后生存驗證，確定有意義的關鍵基因；進而利用TIMER 2.0和TISIDB數(shù)據(jù)庫探討關鍵基因表達與免疫細胞浸潤的相關性；最后構建預后風險模型進行Cox回歸分析。

1.2研究方法

1.2.1基因差異表達分析及驗證:在GEPIA 2.0平臺中選擇FUNCTIONS菜單下的Expression Analysis,然后選擇Differential Genes。篩選條件：①Dataset (Cancer name)選擇胃腺癌；②Differential Methods 選擇 ANOVA；③| Log2FC | Cutoff: 1，q-value Cut off: 0. 01；④Gene/Isoform 選擇 Gene；⑤Chromosomal Distribution 選擇 Both；⑥比對GRCh38. p2(NCBI),得到差異基因和其染色體分布圖。

1.2.2預后差異相關基因分析：在GEPIA 2.0平臺中選擇FUNCTIONS中的Expression Analysis,然后選擇Survival Analysis 再選擇Most Differential Survival Gens。篩選條件：①Datasets Selection 選擇胃腺癌；②Gene/Isoform 選擇Gene；③Methods 為 Overall Survival or Disease Free Survival；④Group Cutoff 為 Median；⑤得到預后總生存期(OS)和無病生存期(DFS)相關基因。

1.2.3韋恩圖和GO、KEGG富集分析：通過韋恩圖對胃腺癌差異基因與預后OS和DFS相關的基因做交集，得到交集基因后應用基因富集軟件FunRich(Version 3.1.3)完成差異相關基因的GO和KEGG富集分析。

1.2.4差異基因表達和預后生存驗證：通過GEPIA 2.0和StarBase v2對鑒定的差異基因進行表達和預后生存驗證，確定胃腺癌差異表達且與預后相關的關鍵基因。

1.2.5關鍵基因表達與免疫細胞浸潤水平、豐度相關性：通過TIMER 2.0和TISIDB數(shù)據(jù)庫分析關鍵基因表達與免疫細胞浸潤水平、豐度的相關性。

1.2.6單因素和多因素Cox回歸分析：從TCGA數(shù)據(jù)庫獲得胃腺癌的RNAseq數(shù)據(jù)(level3)和相應的臨床信息，進行單因素和多因素Cox回歸分析，并通過“Forestplot”包分析每個變量。

2 結果

2.1差異表達基因 應用GEPIA 2.0對TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中408個胃腺癌和211個癌旁組織樣本RNASeq的數(shù)據(jù)進行差異基因篩選，獲得4644個差異表達基因，其中上調基因有3746個，下調基因有898個。上調前10位基因為CEACAM5、CEACAM6、RNU11、CLDN3、CST1、OLFM4、REG4、MUC3A、MUC13和CLDN4，見表1；下調前10位基因為PGA3、PGA4、PGA5、LIPF、GKN1、GIF、PGC、ATP4B、ATP4A和GKN2，見表2。差異表達基因主要染色體分布見圖1。

表1 胃腺癌差異表達基因表達上調前10位基因

表2 胃腺癌差異表達基因表達下調前10位基因

圖1 胃腺癌差異表達基因主要染色體分布

2.2差異表達且與預后生存相關基因 通過韋恩圖對胃腺癌差異基因與預后OS和DFS相關排序前500位基因分別做交集，通過統(tǒng)計得出GFRA3、APBB1、ABCA8、PLCXD3、FAM153B、CLRN3、CD300LG及ASF1B 8個差異表達基因與預后OS、DFS相關，見圖2a；差異表達基因名稱、編號及在胃腺癌與癌旁組織的表達情況及差異性詳見表3。進一步通過GEPIA 2.0進行差異相關基因對比分析，探索8個差異相關基因在31種腫瘤癌與癌旁組織表達的差異熱圖，見圖2b,通過對比熱圖發(fā)現(xiàn)不同腫瘤癌與癌旁組織差異相關基因表達不同，可能與腫瘤的組織特異性有關，為腫瘤的診斷和治療提供了新的思路。

圖2 胃腺癌差異表達基因與預后總生存期(OS)、無病生存期(DFS)相關基因韋恩圖及在不同腫瘤中表達差異熱圖

表3 胃腺癌差異表達且與預后生存相關8個基因

2.3差異相關基因GO和KEGG富集分析 通過基因富集軟件FunRich(Version 3.1.3)對8個差異相關基因進行GO分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集的細胞組分 (cellular component， CC)13個，分子功能(molecular function， MF)6個，生物學過程(biological process， BP)7個；KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)其涉及的通路有3條。CC中主要集中在細胞核(40.0%)、細胞膜(40.0%)、細胞質(40.0%)、膜內(40.0%)和膜外(20.0%) 等13個細胞組分。MF中主要涉及受體活性 (12.5%)、磷脂酶活性(12.5%)、輔助轉運蛋白活性(12.5%)、分子伴侶活性(12.5%)和未知功能(37.5%)等6個功能簇。BP中主要包含信號傳導(25.0%)、細胞通訊(25.0%)、新陳代謝(12.5%)、物質運輸(12.5%)和未知生物學過程(37.5%) 等7個生物過程。KEGG富集分析結果表明，差異相關基因主要參與ABC家族蛋白介導的轉運(50%)、核雌激素受體α網(wǎng)絡(50%)和小分子的跨膜轉運(50%)3條信號通路，見圖3a～3d。

圖3 胃腺癌差異相關基因GO及KEGG富集分析

2.4驗證差異相關基因表達與預后關系 利用GEPIA 2.0和StarBase v2.0基因表達數(shù)據(jù)和臨床信息，驗證篩選到的8個差異相關基因在胃腺癌與癌旁組織的表達及預后分析，最終確定ABCA8、PLCXD3、CLRN3、CD300LG及ASF1B 5個為關鍵基因。①通過驗證表明ABCA8、PLCXD3和CD300LG在胃腺癌組織低表達,CLRN3和ASF1B在胃腺癌組織高表達(P<0.01)，見圖4和圖5。②通過驗證表明在胃腺癌中ABCA8、PLCXD3和CD300LG低表達患者OS和DFS較長，CLRN3和ASF1B高表達患者OS和DFS較長(P<0.05)，見圖6和圖7。

2.5胃腺癌關鍵基因表達與免疫細胞浸潤相關性 通過腫瘤免疫在線研究工具TIMER 2.0和TISIDB數(shù)據(jù)庫探討5個關鍵基因表達與免疫細胞浸潤水平、豐度相關性，發(fā)現(xiàn)5個關鍵基因表達與免疫細胞浸潤水平、豐度具有相關性(r>0.3,P<0.01)，見圖8和9。

圖4 GEPIA 2.0驗證胃腺癌關鍵基因表達

圖5 StarBase v2.0驗證胃腺癌關鍵基因表達

圖6 GEPIA 2.0驗證胃腺癌關鍵基因表達與預后關系

圖7 StarBase v2.0驗證胃腺癌關鍵基因表達與預后關系

2.6關鍵基因預后風險模型Cox回歸分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫獲得375個胃腺癌的RNAseq數(shù)據(jù)(level3)和相應的臨床信息,構建關鍵基因預后風險模型，進行單因素和多因素Cox回歸分析。單因素Cox回歸分析顯示5個關鍵基因(ABCA8、ASF1B、CD300LG、CLRN3、PLCXD3)、性別、pTNM分期及病理分級是胃腺癌預后的相關風險因素(P<0.05，P<0.01)；多因素Cox回歸分析顯示性別、pTNM分期和病理分級是胃腺癌預后的獨立風險因素(P<0.01),詳見表4。

3 討論

胃癌發(fā)病率男性是女性的2倍，在東亞和東歐發(fā)病率最高，其為發(fā)病率和病死率最高的三大癌癥之一[3]。胃腺癌是胃癌的主要類型，可能由飲食習慣、激素水平、慢性胃炎及幽門螺旋桿菌感染等多種因素引起，現(xiàn)其發(fā)病機制仍不清楚。雖然早期胃癌患者術后5年生存率為90%，但胃癌患者發(fā)現(xiàn)時多位于晚期[5]。近年來胃癌診治手段已經(jīng)有了很大進展,但在我國胃癌的5年生存率僅為35.9%,遠低于日本的60.3%和韓國的68.9%[6]。隨著新的技術發(fā)展，尤其是分子生物學、基因芯片、生物信息技術及大數(shù)據(jù)等在醫(yī)療領域的應用,腫瘤的早期診斷和精準治療成為當前研究的熱點。胃腺癌的研究轉向分子水平的發(fā)病機制、驅動基因、診斷標志物及靶向治療的研究。因此,探討與胃腺癌診療相關的分子標志物，對其預后改善具有重要意義。

本研究通過可視化腫瘤數(shù)據(jù)分析平臺GEPIA 2.0進行差異基因和預后生存相關基因鑒定，并使用韋恩圖篩選與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預后相關的關鍵基因，通過不同數(shù)據(jù)庫驗證及免疫浸潤探討、預后風險模型預測，最終確定ABCA8、PLCXD3、CLRN3、CD300LG及ASF1B 5個基因為胃腺癌進展與預后的關鍵基因，其表達與免疫細胞浸潤具有相關性，且可作為預后風險模型的相關風險因素。

ABCA8位于人類第17條染色體長臂2區(qū)4帶2亞帶(17q24.2)，屬ABC轉運蛋白超家族成員，編碼的蛋白質可能調節(jié)脂質代謝并參與髓鞘的形成和維持，然而最近發(fā)現(xiàn)其在部分腫瘤中發(fā)揮重要的功能作用。有學者在肝細胞癌中發(fā)現(xiàn)ABCA8表達下調,其過表達后抑制肝細胞癌的生長和轉移，且低表達患者預后OS較長[7]，這與本研究結果相同。ZHANG等[8]也發(fā)現(xiàn)ABCA8在肝細胞癌中表達下調，而低表達患者生存時間顯著縮短。另有文獻報道ABCA8通過激活ERK信號通路不但促進人胰腺癌細胞的遷移和侵襲，而且還顯著降低了人胰腺癌細胞在體外和體內對吉西他濱的敏感性[9-10]，這與陳靜等[11]發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤細胞中ABCA8參與耐藥的結果一致。近期有學者在對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)ABCA8可通過調控AMP活化蛋白激酶/哺乳動物西羅莫司靶點信號通路抑制乳腺癌細胞增殖[12]。我們通過生物信息分析發(fā)現(xiàn)ABCA8在胃腺癌中也異常表達，參與腫瘤的進展、預后，與CD4+、巨噬細胞、樹突狀細胞的免疫浸潤水平相關性較高。

圖8 TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫探討關鍵基因表達與胃腺癌免疫細胞浸潤水平相關性

圖9 TISIDB數(shù)據(jù)庫探討關鍵基因表達與胃腺癌免疫細胞浸潤豐度相關性

表4 胃腺癌患者關鍵基因預后風險模型單因素和多因素Cox回歸分析

PLCXD3位于人類第5條染色體長臂1區(qū)3帶1亞帶(5q13.1)，屬磷酸肌醇特異性磷脂酶家族成員。此前，有研究發(fā)現(xiàn)胰腺β細胞中PLCXD3的低表達與關鍵胰島素信號傳導、胰島素生物合成基因下調及葡萄糖感應降低有關，并且與代謝綜合征風險相關[13-14]。近期有研究報道PLCXD3在尿路上皮癌中低表達[15]，與本研究顯示PLCXD3在胃腺癌中表達一致。此外，CHEN等[16]通過對胃腺癌轉錄組調控的綜合基因組和表觀基因組分析發(fā)現(xiàn)PLCXD3在侵襲性胃腺癌的發(fā)展中發(fā)揮了關鍵作用,免疫浸潤分析其表達與CD4+、CD8+、巨噬細胞和中性粒細胞的富集水平呈正相關。本研究發(fā)現(xiàn)PLCXD3表達與CD4+、巨噬細胞、肥大細胞、激活B細胞和嗜酸粒細胞的浸潤豐度相關性較高。

CLRN3位于人類第10條染色體長臂2區(qū)6帶2亞帶(10q26.2)，編碼一種細胞外泌體蛋白，主要富集在小腸、結腸、十二指腸、肝和腎等，現(xiàn)對其基因及蛋白研究甚少，其作用和功能尚不清楚。MALLANNA等[17]發(fā)現(xiàn)CLRN3在肝細胞分化的最后階段高度富集。然而，ZENG等[18]研究分析證實CLRN3可能是子宮內膜癌的特定甲基化驅動基因，參與其發(fā)生機制，并且與OS顯著相關。本研究首次發(fā)現(xiàn)CLRN3在胃腺癌中高表達，且高表達患者OS、DFS較長，與效應記憶CD8+、自然殺傷T細胞、1型T輔助細胞等免疫浸潤豐度呈負相關。

CD300LG位于人類第17條染色體長臂2區(qū)1帶3亞帶1次亞帶(17q21.31)，編碼一種包含單個免疫球蛋白V樣結構域的Ⅰ型細胞表面糖蛋白。ZHAI等[19]發(fā)現(xiàn)CD300LG在肺癌中表達下調，可能導致免疫細胞殺傷功能受到抑制，導致癌細胞免疫逃逸；而另有報道顯示CD300LG可提高細胞因子誘導殺傷的細胞毒活性[20]。此外，在乳腺癌[21]和急性髓系白血病[22]中也發(fā)現(xiàn)CD300LG表達下調。本研究首次發(fā)現(xiàn)CD300LG在胃腺癌中低表達，且低表達患者OS、DFS較長，與CD4+、巨噬細胞、樹突狀細胞、激活B細胞等免疫浸潤豐度相關性較高。

ASF1B位于人類第19條染色體長臂1區(qū)3帶1亞帶2次亞帶(19q13.12)，屬伴侶蛋白 H3/H4 家族的成員，編碼的蛋白為細胞周期調節(jié)激酶類凌亂樣激酶家族的底物，在調節(jié)染色質的核小體結構中發(fā)揮關鍵作用，其在腫瘤的表達與免疫浸潤成為近年來研究的熱點。OUYANG等[23]在肝細胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)ASF1B高表達，高表達患者擁有低生存率，且與免疫細胞浸潤顯著相關。另外，在膠質瘤和胰腺癌中同樣發(fā)現(xiàn)ASF1B表達顯著升高，且是預后不良的因素[24-25]。本研究在胃腺癌患者中發(fā)現(xiàn)ASF1B高表達，且高表達患者預后較好，免疫浸潤分析顯示其表達與巨噬細胞、CD4+、B細胞等免疫浸潤呈負相關。

總之，本研究基于TCGA、GTEx、GEPIA 2.0、StarBase v2.0、TIMER 2.0、TISIDB數(shù)據(jù)庫及FunRich軟件，以及從TCGA數(shù)據(jù)庫獲得胃腺癌的RNAseq數(shù)據(jù)(level3)和相應的臨床信息，進行單因素和多因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)ABCA8、PLCXD3、CLRN3、CD300LG及ASF1B 5個基因在胃腺癌中異常表達，且與預后相關，并與免疫細胞浸潤具有相關性，可作為預后風險模型的相關風險因素，其中CLRN3和CD300LG是首次被報道在胃腺癌異常表達且參與腫瘤免疫細胞浸潤。